劉軍 劉騫 程運(yùn)斌 沈菁 陳鑫

摘要?[目的]建立一種簡(jiǎn)單高效測(cè)定柑橘全果和果肉中戊唑醇和吡唑醚菌酯殘留量的方法。[方法]柑橘全果和果肉樣品經(jīng)過乙腈提取、PSA和C18凈化，過膜后采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。[結(jié)果]柑橘全果和果肉樣品中戊唑醇和吡唑醚菌酯的平均回收率分別為95%～121%和95%～123%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.5%～6.0%和2.1%～9.5%，符合農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留分析要求;在0.005～0.200 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。[結(jié)論]該方法操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，完全能夠滿足柑橘全果和果肉中戊唑醇和吡唑醚菌酯殘留量的日常檢測(cè)需要。

關(guān)鍵詞?柑橘;戊唑醇;吡唑醚菌酯;高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類號(hào)?TS207.5+3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào)?0517-6611（2018）35-0171-03

柑橘是一類十分重要的水果，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，廣受人們喜愛。它在世界各地均有種植，具有較大的種植面積和較高的產(chǎn)量，已經(jīng)成為世界上第三大貿(mào)易農(nóng)產(chǎn)品[1]。我國是柑橘重要的產(chǎn)地之一，并且我國柑橘種植面積和產(chǎn)量位居世界之首[2]。在我國，柑橘主要分布于16°～?37°N，是我國重要的產(chǎn)業(yè)之一。然而，柑橘在生長(zhǎng)發(fā)育過程中容易遭受到病蟲害（如瘡痂病、炭疽病、黑斑病、樹脂病、潛葉蛾和紅蜘蛛等）的影響，這給柑橘的經(jīng)濟(jì)價(jià)值帶來極大的損失。

為了減輕病蟲害對(duì)柑橘造成的不利影響，越來越多的農(nóng)藥在柑橘上獲得登記使用。其中，戊唑醇和吡唑醚菌酯是2種十分有效的殺菌劑[3]。戊唑醇是一種高效、廣譜、內(nèi)吸性三唑類殺菌農(nóng)藥，對(duì)柑橘的瘡痂病、炭疽病、黑斑病和樹脂病等有較好的防治效果。吡唑醚菌酯是一種新型廣譜殺菌農(nóng)藥，其作用機(jī)理為線粒體呼吸抑制劑，對(duì)柑橘的瘡痂病、樹脂病和炭疽病等也有較好的防治效果。目前，檢測(cè)戊唑醇和吡唑醚菌酯的方法主要有液相色譜法[4-5]、氣相色譜法[6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7-8]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-10]。而關(guān)于同時(shí)檢測(cè)柑橘中戊唑醇和吡唑醚菌酯2種農(nóng)藥的殘留量的報(bào)道尚少。因此，該研究擬建立一種簡(jiǎn)單快速且可同時(shí)檢測(cè)柑橘全果和果肉中戊唑醇和吡唑醚菌酯殘留量的方法。

1?材料與方法

1.1?試劑和材料

戊唑醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度95.6%，德國拜耳公司）;吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.7%，上海農(nóng)藥研究所）;甲醇、甲酸、乙腈（色譜純，美國J.T.Baker公司）;乙腈（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;氯化鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;提取鹽包（6 g MgSO4+1.5 g NaOAc，島津技邇（上海）商貿(mào)有限公司）;凈化管[50 mg PSA+50 mg C18+150 mg MgSO4，2 mL，島津技邇（上海）商貿(mào)有限公司];0.22 μm尼龍濾膜（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;試驗(yàn)用水為超純水;柑橘購置于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2?主要儀器設(shè)備

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀LC-MS-MS[島津高效液相色譜儀LC 30AD，配備電噴霧離子源（ESI）的AB SCIX QTRAP 4500質(zhì)譜儀，Analyst工作站];色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18，長(zhǎng)度100 mm，直徑2.1 mm，填料粒徑1.7 μm（Waters，美國沃特斯公司）;MS3渦旋混合器（IKA，德國）;Stephan UMC 5食品粉碎機(jī)（Stephan，德國）;T25分散器（IKA，德國）;TDL-40B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）;XP504R型電子天平（瑞士Mettle Toledo公司）;Milli-Q型超純水機(jī)（美國Millipore公司）。

1.3?分析方法

1.3.1?樣品提取及凈化。

1.3.1.1?提取。將柑橘全果和柑橘果肉樣品分別用食品粉碎機(jī)打碎成泥狀，然后稱取10.0 g樣品置于80 mL離心管中，再加入20 mL （柑橘全果）或10 mL（柑橘果肉）分析純乙腈。使用T25分散器以15 000 r/min高速勻漿提取1 min。加入3 g氯化鈉后使用T25分散器再勻漿提取1 min，然后4 000 r/min離心6 min。

1.3.1.2?凈化。吸取1 mL上清液于2 mL凈化管（50 mg PSA+50 mg C18+150 mg MgSO4），渦旋混勻1 min，再10 000 r/min離心5 min。取上清液經(jīng)0.22 μm尼龍濾膜過濾于樣品瓶中，待LC-MS-MS檢測(cè)。

1.3.2?儀器檢測(cè)條件。

1.3.2.1?液相條件。流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為色譜純的乙腈;流速0.3 mL/min;流動(dòng)相采用梯度模式：0～0.5 min保持流動(dòng)相B為20%，0.5～2.5 min流動(dòng)相B由20%增加至80%，2.5～3.0 min保持流動(dòng)相B為80%，3.0～3.5 min流動(dòng)相B由80%降低至20%，3.5～4.5 min保持流動(dòng)相B為20%;進(jìn)樣體積為1 μL;柱溫為40 ℃。在此條件下，戊唑醇的保留時(shí)間為3.64 min，吡唑醚菌酯的保留時(shí)間為4.04 min。

1.3.2.2?質(zhì)譜條件。多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式掃描;電噴霧正離子源（ESI+）;離子化電壓為5 500 V;離子源溫度為500 ℃;氣簾氣壓力241.3 kPa;噴霧氣壓力為344.7 kPa;輔助加熱氣壓力為344.7 kPa;碰撞氣為中等模式。具體質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見表1。

1.4?標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

分別稱取適量的戊唑醇和吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品溶于色譜純甲醇中，配制成濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再用色譜純甲醇稀釋成40 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。檢測(cè)時(shí)再用乙腈稀釋配得0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200 mg/L的系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.5?基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

分別取制備好并經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)不含目標(biāo)化合物的柑橘全果和果肉樣品，按照“1.3.1”的方法進(jìn)行提取和凈化，得到柑橘全果和果肉樣品的基質(zhì)。然后使用這2種基質(zhì)分別配制濃度為0.01和0.10 mg/L的基質(zhì)混合標(biāo)樣。此外，使用乙腈溶液配制對(duì)應(yīng)濃度的溶劑混合標(biāo)樣。最后，按照“1.3.2”的條件測(cè)定基質(zhì)混合標(biāo)樣和溶劑混合標(biāo)樣，獲得相應(yīng)的峰面積。按照公式（1）計(jì)算并評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)（ME）。當(dāng)ME>20%時(shí)，表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng);ME<20%時(shí)，表示基質(zhì)抑制效應(yīng);當(dāng)ME為-20%～20%時(shí)，表示基質(zhì)效應(yīng)可忽略。

ME=（AJB-ARB）/ARB×100%（1）

其中，ME表示基質(zhì)效應(yīng)，AJB表示基質(zhì)標(biāo)樣峰面積，ARB表示溶劑標(biāo)樣峰面積。

1.6?添加回收試驗(yàn)

分別取制備好并經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)不含目標(biāo)化合物的柑橘全果和果肉樣品，加入一定量的戊唑醇和吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.3.1”的方法進(jìn)行提取和凈化，按照“1.3.2”的條件測(cè)定回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。戊唑醇和吡唑醚菌酯在柑橘全果和柑橘果肉中的添加水平分別為0.02、0.20、2.00 mg/kg以及0.01、0.10、1.00 mg/kg，每個(gè)濃度重復(fù)5次。

2?結(jié)果與分析

2.1?樣品前處理?該研究的前處理過程簡(jiǎn)單、高效，而且所需的設(shè)備也較為簡(jiǎn)單。首先，在提取方面，該研究采用了較為常用的提取溶劑乙腈，而且用量也相對(duì)較少，既降低了成本也減少了廢棄物的排放。另外，該提取過程所需的時(shí)間較短，相比于傅強(qiáng)等[8]的提取方法效率更高。其次，在凈化方面，該研究采用了果蔬中農(nóng)藥殘留分析常用的QuEchERS方法。相比于傳統(tǒng)的固相萃取小柱凈化的步驟更為簡(jiǎn)單，成本也更加低廉[4]。該凈化方法極大地節(jié)約了前處理的時(shí)間，為大批量樣品的處理提供了有效的方法。該研究中的凈化方法對(duì)柑橘全果和柑橘果肉2種基質(zhì)均有效，凈化效果好，目標(biāo)物的峰不受雜質(zhì)的影響，完全能夠滿足戊唑醇和吡唑醚菌酯的殘留分析。

2.2?線性關(guān)系和檢出限

按照“1.3.2”的方法將戊唑醇和吡唑醚菌酯的系列標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液進(jìn)行平行測(cè)定3次。以定量離子峰3次測(cè)定峰面積的平均值為縱坐標(biāo)，以濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。戊唑醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=3.06×107x-2 061，相關(guān)系數(shù)為0.999;吡唑醚菌酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=4.59×107x+4.19×105，相關(guān)系數(shù)為0.989。可見，戊唑醇和吡唑醚菌酯在0.005～0.200 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，與王素茹等[4] 和傅強(qiáng)等[8]所報(bào)道的結(jié)果一致。

2.3?基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

按照“1.5”進(jìn)行的基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)結(jié)果如表2所示，在0.01和0.10 mg/L濃度下，柑橘全果和果肉中戊唑醇和吡唑醚菌酯的基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)值均為-20%～20%，不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)。這表明該研究的前處理方法較好地消除了基質(zhì)效應(yīng)，在定量的過程中無需考慮基質(zhì)效應(yīng)，可采用溶劑標(biāo)樣進(jìn)行定量分析。

2.4?方法回收率和精密度

從表3可看出，柑橘全果和柑橘果肉樣品中戊唑醇和吡唑醚菌酯的平均回收率分別為95%～121%和95%～123%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.5%～6.0%和2.1%～9.5%，表明該研究方法有較高的回收率和較

好的精密度。通過添加回收試驗(yàn)確定柑橘全果的定量限為0.02 mg/kg，柑橘果肉的定量限為0.01 mg/kg?？梢?，該研究的分析方法完全適合柑橘全果和果肉中戊唑醇和吡唑醚菌酯的殘留分析。

46卷35期?劉 軍等?高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定柑橘中戊唑醇和吡唑醚菌酯的殘留

3?結(jié)論

該研究建立了一種簡(jiǎn)單高效的、可同時(shí)檢測(cè)柑橘全果和果肉中戊唑醇和吡唑醚菌酯的殘留方法。用乙腈提取柑橘全果和果肉中戊唑醇和吡唑醚菌酯，提取效率高。使用QuEChERS凈化，步驟少、耗時(shí)短且凈化效果好，消除了基質(zhì)效應(yīng)。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定性定量特異性強(qiáng)、靈敏度高。柑橘全果和果肉樣品中戊唑醇和吡唑醚菌酯的平均回收率分別為95%～121%和95%～123%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.5%～6.0%和2.1%～9.5%。該分析方法能夠滿足日常檢測(cè)的需要，為農(nóng)產(chǎn)品中戊唑醇和吡唑醚菌酯的殘留檢測(cè)提供了重要的參考。

參考文獻(xiàn)

[1] 董世平，杜芳林，廖洪，等.世界柑橘貿(mào)易趨勢(shì)及縣域產(chǎn)業(yè)振興對(duì)策[J].作物研究，2018，32（7）：58-62.

[2] 沈兆敏.努力實(shí)現(xiàn)我國柑橘產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化[J].果農(nóng)之友，2017（12）：1-2，24.

[3] 劉希玲，董立峰，邵彥坡，等.38%吡唑醚菌酯·戊唑醇懸浮劑的研制[J].今日農(nóng)藥，2016（12）：17-18，26.

[4] 王素茹，葛會(huì)林，韓丙軍，等.香蕉及土壤中吡唑醚菌酯和戊唑醇?xì)埩舻母咝б合嗌V分析[J].吉林農(nóng)業(yè)，2017（18）：70-72.

[5] 毛江勝，邵其霞，郭長(zhǎng)英，等.40%吡唑醚菌酯·戊唑醇懸浮劑在玉米及土壤中的殘留與降解[J].農(nóng)藥，2017，56（11）：832-835.

[6] 楊茜茹，范力欣，錢訓(xùn).氣相色譜法檢測(cè)小麥籽粒、植株及土壤中吡唑醚菌酯殘留量[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2017，8（4）：1460-1465.

[7] WANG Z W，CANG T，QI P P，et al.Dissipation of four fungicides on greenhouse strawberries and an assessment of their risks[J].Food control，2015，55：215-220.

[8] 傅強(qiáng)，聶思橋，任競(jìng)，等.戊唑醇和吡唑醚菌酯在玉米植株和土壤中殘留及其消解動(dòng)態(tài)的檢測(cè)[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，41（6）：661-665.

[9] FILHO A M，DOS SANTOS F N，DE PAULA PEREIRA P A.Development，validation and application of a methodology based on solid-phase microextraction followed by gas chromatography coupled to mass spectrometry （SPME/GCMS） for the determination of pesticide residues in mangoes[J].Talanta，2010，81（1/2）：346-354.

[10] 張娟，汪杰，姚成虎.分散固相萃取-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大米中的毒死蜱、三環(huán)唑和戊唑醇?xì)埩鬧J].農(nóng)藥，2018，57（11）：823-825，847.