徐浩 張寧 衛(wèi)民 楊靜 樊洪玉 趙劍 解靜聰 蔣劍春

摘要?[目的]通過灰蓋鬼傘菌DSM-886固態(tài)發(fā)酵提高豆粕的飼用價(jià)值。[方法]利用灰蓋鬼傘菌菌絲體發(fā)酵工藝提高了豆粕的營養(yǎng)價(jià)值，并研究了發(fā)酵前后豆粕營養(yǎng)成分的變化。豆粕經(jīng)灰蓋鬼傘菌固態(tài)發(fā)酵96 h后，分析其拮抗因子的變化，并通過對(duì)蛋白質(zhì)的提取與分析，研究了發(fā)酵前后蛋白肽分布特性與氨基酸模式的變化。[結(jié)果]發(fā)酵過程消除了大豆粕中91%的胰蛋白酶抑制因子，組氨酸的總含量提高了217%，同時(shí)將豆粕中肽分子量降至20 ku以下。菌絲體發(fā)酵后的豆粕具有新的營養(yǎng)特性使之更能適應(yīng)某些動(dòng)物特別是幼畜的營養(yǎng)需求，同時(shí)發(fā)酵過程中產(chǎn)生的漆酶對(duì)黃曲霉毒素具有一定的降解作用，可提高飼料的安全性。[結(jié)論]作為蕈菌的典型菌株，灰蓋鬼傘菌的菌絲體發(fā)酵研究可為其他食用菌菌絲體的發(fā)酵過程提供參考。

關(guān)鍵詞?灰蓋鬼傘菌;食用菌;飼料;發(fā)酵;豆粕

中圖分類號(hào)?S816.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2018）35-0091-03

大豆作為重要的糧食作物，同時(shí)也是食用植物油的主要來源之一，豆粕是大豆經(jīng)過油脂提取后得到的副產(chǎn)物。豆粕含有豐富的植源性蛋白，是飼料工業(yè)主要的蛋白質(zhì)來源[1]。與其他產(chǎn)油作物的加工剩余物相比，豆粕具有較高的粗蛋白含量（43.8%～47.5%）[2]。然而，由于氨基酸組成不平衡、存在營養(yǎng)拮抗因子以及適口性差等原因，豆粕并不適合作為水產(chǎn)動(dòng)物飼料與幼畜飼料[3-6]。目前，提高豆粕飼用性能的主要研究方向是通過微生物發(fā)酵提高其植源性蛋白的可消化吸收性。研究表明，在諸多用于固態(tài)發(fā)酵的菌株中，米曲霉的發(fā)酵性能較為突出，通過米曲霉發(fā)酵過程可降低豆粕胰蛋白酶抑制因子84.4%、植源性蛋白肽分子量大小62.5%[7]。除了蛋白質(zhì)的可消化吸收性外，氨基酸模式也是提高植源性原料飼用性能的重要因素。以白腐菌為代表的大型高等真菌具有高生物轉(zhuǎn)化率的同時(shí)，氨基酸模式也與動(dòng)物性蛋白源更為接近。黃曲霉毒素同樣是衡量原料飼用價(jià)值的重要指標(biāo)之一，白腐菌漆酶對(duì)黃曲霉毒素的降解有顯著效果[8]。根據(jù)德國TRBA標(biāo)準(zhǔn)與美國BSL生物安全等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，灰蓋鬼傘菌的安全級(jí)別均為1級(jí)，無潛在危害?；疑w鬼傘菌作為白腐菌的典型菌株，具有生命周期短、菌絲生長快等特點(diǎn)，同時(shí)基因組中含有白腐菌中最大的漆酶家族以及多種抑菌蛋白，因此作為豆粕的飼用發(fā)酵菌株具有一定的研究價(jià)值[9]。 筆者通過灰蓋鬼傘菌DSM-886固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，分析了發(fā)酵前后豆粕的營養(yǎng)成分、氨基酸組成、豆粕蛋白肽分子量大小的分布等指標(biāo)的變化。

1?材料與方法

1.1?菌種

灰蓋鬼傘菌DSM-886購自DSMZ（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH）。

1.2?發(fā)酵方法

將干燥的豆粕與蒸餾水混勻，含水量為40%;于70 ℃條件下滅菌60 min，冷卻至室溫。滅菌后的豆粕接種灰蓋鬼傘菌孢子懸液10 mL/kg（約1.0×106個(gè)孢子）;37 ℃條件下固態(tài)發(fā)酵96 h。發(fā)酵結(jié)束后60 ℃條件下烘干至含水量約10%。

1.3?化學(xué)成分分析

化學(xué)成分分析項(xiàng)目包括水分含量（紅外水分測定儀OHAUS MB120）、粗蛋白含量（GB/T 6432—1994）、粗脂肪含量（GB/T 6433—2006）、粗灰分含量（GB/T 6438—2007）、氨基酸含量（Agilent 1200 SL ZORBAX Eclipse Plus C18 Columns）、胰蛋白酶抑制因子含量[10]、漆酶活性[11]以及發(fā)酵豆粕的消化與吸收性能[12]。

1.4?蛋白提取與分離

發(fā)酵豆粕與未發(fā)酵豆粕中蛋白的提取采用Faurobert[13]的方法。樣品經(jīng)由分析用研磨機(jī)（A11 BASIC ANALYTICAL MILL 115 V，IKA-Laboratechnik）粉碎后，與20 mmol/L含有0.1%十二烷基硫酸鈉、5 mmol/L二硫蘇糖醇、5 μg/mL 蛋白酶抑制劑混合物（Promega）的 Tris-HCl buffer（pH 7.6）以1∶40的比例在冰上混勻5 min?；靹蚝蟮臉悠吩? ℃、10 000 r/min條件下離心15 min（Avanti JXN-30/26，Beckman，F(xiàn)ullerton，CA），取上清液1.5 mL，備用。蛋白質(zhì)吸光度的測定使用BioRad Protein Assay Kit（產(chǎn)品編號(hào)500-0001）與分光光度計(jì)（UV-2550，Shimadzu）在595 nm波長下測定。標(biāo)準(zhǔn)曲線使用（產(chǎn)品編號(hào)500-0007，Bio-Rad）制作。蛋白分離采用SDS-PAGE方法[14]。取8 μg上清蛋白于90 mV條件下分離180 min。加入Coomassie Brilliant Blue R-250（BioRad）染色60 min后，放入10%醋酸、45%甲醇溶液中洗脫過夜。

1.5?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

蛋白印跡條帶使用UN-SCAN-IT-gelTM（version 6.1，Silk Scientific，Inc.，Orem，UT）軟件進(jìn)行分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?化學(xué)成分分析

由表1可知，經(jīng)過96 h固態(tài)發(fā)酵，豆粕的主要營養(yǎng)成分發(fā)生改變。發(fā)酵后豆粕的粗蛋白含量較發(fā)酵前降低2.85%，粗脂肪含量較發(fā)酵前增加133.72%。高等真菌固態(tài)發(fā)酵過程中粗蛋白含量的降低往往是因?yàn)榕囵B(yǎng)基的碳氮比較低，高等真菌的蛋白脫氨途徑被激活，在米曲霉發(fā)酵豆粕的研究中也存在同樣的現(xiàn)象[15-16]。脂肪含量的提高對(duì)于飼料營養(yǎng)的改善具有很高的價(jià)值，以食用菌為代表的大型真菌脂肪總類較為齊全，包括甘油單酯、甘油雙酯、甘油三脂、游離脂肪酸、甾醇、磷酸酯等，其中非飽和脂類含量占主要比例，可起到降低動(dòng)物脂肪肝風(fēng)險(xiǎn)的作用[17]。胰蛋白酶抑制因子較發(fā)酵前同比降低91.10%，該水平下不再對(duì)飼用蛋白的吸收性產(chǎn)生拮抗效應(yīng)[18-19]。發(fā)酵后漆酶酶活達(dá)1.46 U/g。體外試驗(yàn)顯示，發(fā)酵豆粕的消化性與吸收性分別提高了12.44%和5.41%。

2.2?氨基酸模式分析

由表2可知，組氨酸含量的變化最為顯著，較發(fā)酵前提高了217.27%。組氨酸作為大多數(shù)魚類的必需氨基酸對(duì)鱸魚、黃魚、青魚等魚類的終末體質(zhì)量和特定生長率有顯著影響[20]，對(duì)肉雞、鵝等禽類的養(yǎng)分利用率影響顯著[21]，同時(shí)可以改善大鼠的炎癥與氧化應(yīng)激機(jī)制[22]。其他必需氨基酸中，精氨酸與賴氨酸含量的下降較為顯著，分別為63.59%和20.00%;總氨基酸含量較發(fā)酵前降低了5.26%。

2.3?蛋白印記分析

通過蛋白印記條帶分析豆粕發(fā)酵前后蛋白質(zhì)分子大小的變化發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程顯著改變了豆粕的蛋白特性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，發(fā)酵前豆粕蛋白分子大小主要分布在40～60 ku（49.06%），大于60 ku的蛋白分子占28.97%，小于20 ku的蛋白分子占21.96%。絕大多數(shù)蛋白分子被降解到20 ku以下。由于幼齡動(dòng)物的消化與分泌系統(tǒng)不完善，相對(duì)較小的蛋白分子量更有利于幼齡動(dòng)物蛋白質(zhì)營養(yǎng)的吸收[23-24]。

3?結(jié)論

（1）化學(xué)分析結(jié)果表明，灰蓋鬼傘菌DSM-886具有改善豆粕營養(yǎng)特性、降低飼料安全風(fēng)險(xiǎn)的能力，發(fā)酵后豆粕粗脂肪含量提高了133.72%，胰蛋白酶抑制因子降低了91.10%，漆酶酶活達(dá)到1.46 U/g;發(fā)酵豆粕的體外消化性與吸收性分別提高了12.44%與5.41%。

（2）氨基酸模式分析表明，該菌株可以顯著提高豆粕中組氨酸含量，固態(tài)發(fā)酵96 h組氨酸含量提高了217.27%。

（3）蛋白印跡條帶分析表明，該菌株發(fā)酵的豆粕可用于幼畜飼料的配制，固態(tài)發(fā)酵96 h豆粕蛋白質(zhì)分子量降至20 ku以下。

參考文獻(xiàn)

[1] KIKUCHI K.Use of defatted soybean meal as a substitute for fish meal in diets of Japanese flounder（Paralichthys olivaceus）[J].Aquaculture，1999，179（1/2/3/4）：3-11.

[2] RAVINDRAN V，ABDOLLAHI M R，BOOTWALLA S M.Nutrient analysis，metabolizable energy，and digestible amino acids of soybean meals of different origins for broilers[J].Poultry science，2014，93（10）：2567-2577.

[3] DUNSFORD B R，KNABE D A，HAENSLY W E.Effect of dietary soybean meal on the microscopic anatomy of the small intestine in the early-weaned pig[J].Journal of animal science，1989，67（7）：1855-1863.

[4] JIANG R H，CHANG X，STOLL B，et al.Dietary plasma protein is used more efficiently than extruded soy protein for lean tissue growth in early-weaned pigs[J].The journal of nutrition，2000，130（8）：2016-2019.

[5] LI D F，NELSSEN J L，REDDY P G，et al.Transient hypersensitivity to soybean meal in the early-weaned pig[J].Journal of animal science，1990，68（6）：1790-1799.

[6] ELSAYED A F M.Evaluation of soybean meal，spirulina meal and chicken

offal meal as protein sources for silver seabream（Rhabdosargus sarba）fingerlings[J].Aquaculture，2012，127（2/3）：169-176.

[7] HONG K J，LEE C H，KIM S W.Aspergillus oryzae GB107 fermentation improves nutritional quality of food soybeans and feed soybean meals[J].Journal of medicinal food，2004，7（4）：430-435.

[8] 王會(huì)娟，劉陽，邢福國.高產(chǎn)漆酶平菇的篩選及其在降解黃曲霉毒素B1中的應(yīng)用[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2012，26（7）：1025-1030.

[9] HOEGGER P J，NAVARROGONZLEZ M，KILARU S，et al.The laccase gene family in Coprinopsis cinerea（Coprinus cinereus）[J].Current genetics，2004，45（1）：9-18.

[10] FIRESTONE D.Official methods and recommended practices of the AOCS[M].Champaign：AOCS，2009.

[11] 李梅，吳小波，李萌，等.糙皮側(cè)耳以果皮為基質(zhì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶及其酶學(xué)性質(zhì)的研究[J].食用菌學(xué)報(bào)，2018，25（1）：60-66.

[12] WONGPUTTISIN P，KHANONGNUCH C，KHONGBANTAD W，et al.Screening and selection of Bacillus spp.for fermented corticate soybean meal production[J].Journal of applied microbiology，2012，113（4）：798-806.

[13] FAUROBERT M.Application of two-dimensional gel electrophoresis to Prunus armeniaca leaf and bark tissues[J].Electrophoresis，1997，18（1）：170-173.

[14] THOMAS B.The cell cycle：Cold spring harbor symposia on quantitative biology[J].Biochemical education，2010，20（3）：192.

[15] ZAMORA R G，VEUM T L.The nutritive value of dehulled soybeans fermented with Aspergillus oryzae or Rhizopus oligosporus as evaluated by rats[J].Journal of nutrition，1979，109（7）：1333-1339.

[16] ZHU Y，KNOL W.Comparison of fermentation profiles between lupine and soybean by Aspergillus oryzae and Aspergillus sojae in solid-state culture systems[J].Journal of agricultural & food chemistry，1998，46（8）：3376-3380.

[17] 田楓，齊曉旭，鄭振輝.富含不飽和脂肪酸飼料對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)及主要臟器的影響[J].四川動(dòng)物，2008，27（6）：1133-1135.

[18] SCHULZE H，HUISMAN J，VERSTEGEN M W A，et al.Physiological effects of isolated soya trypsin inhibitors（sTT）on pigs[J].Naval research lab report，1993，1（5）：102-105.

[19] JANSMAN A J M，HUISMAN J，BEELEN G M，et al.Effects of soya trypsin inhibitors on faecal nutrient digestibility and nitrogen retention in young piglets[J].Eaap publication，1998，1（5）：102-105.

[20] 李燕.鱸魚和大黃魚支鏈氨基酸與組氨酸營養(yǎng)生理的研究[D].青島：中國海洋大學(xué)，2010.

[21] 蔣銀屏.去盲腸對(duì)鵝飼料養(yǎng)分利用率的影響[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2013.

[22] 孫曉偉.組氨酸改善肥胖大鼠炎癥和氧化應(yīng)激的研究[D].哈爾濱：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，2014.

[23] XU R J，CRANWELL P D.Development of gastric acid secretion in pigs from birth to thirty six days of age：The response to pentagastrin[J].Journal of developmental physiology，1990，13（6）：315-326.

[24] VARLEY M A.The neonatal pig：Development and survival[J].Cab international，1995，93（10）：2567-2577.