周東興，王廣棟，鄔欣慧， 寧玉翠，李 晶，李 磊，曹 旭

（1.東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱 150030）

我國是農(nóng)業(yè)大國，每年農(nóng)作物秸稈年產(chǎn)量高達7億t[1]，但利用率僅3%，每年有超過70%秸稈作為燃料或在田間被直接焚燒，污染環(huán)境。纖維素作為秸稈主要成分，是自然界中數(shù)量最大、分布最廣泛、來源最豐富的碳水化合物，也是地球上數(shù)量最大可再生資源之一[2]。纖維素具有降解困難、降解率低特性[3-4]，高效、充分利用纖維素成為研究熱點[5-6]。傳統(tǒng)物理、化學降解成本高，難以大規(guī)模推廣并應(yīng)用。近年開發(fā)的新纖維素資源利用技術(shù)，仍存在轉(zhuǎn)化利用率低、時間長等問題[7]。利用微生物產(chǎn)生纖維素酶降解纖維素，具有條件溫和、產(chǎn)物產(chǎn)率高和無二次污染等特點，成為目前有效且更接近自然生態(tài)的纖維素處理方法[8]。研究者從篩選纖維素酶生產(chǎn)菌[9]和優(yōu)化菌產(chǎn)纖維素酶條件[10]等方面開展研究。纖維素酶來源廣泛，昆蟲、軟體動物、原生動物、細菌、放線菌、真菌等均可產(chǎn)生纖維素酶[11]，發(fā)現(xiàn)高效降解纖維素微生物是研究重點。

堆肥中含有大量纖維素降解微生物，劉曉梅等利用杏鮑菇菌渣分離篩選出高效纖維素菌株為菌渣發(fā)酵腐熟堆肥提供優(yōu)質(zhì)菌種[12]，易旻等從雞糞蘑菇渣高溫堆肥中解淀粉芽孢桿菌[13]，張喜慶從自然發(fā)酵牛糞中篩選一株枯草芽孢桿菌，在堆肥發(fā)酵方面具有較大應(yīng)用潛力[14]。本研究從以牛糞和秸稈為原材料腐熟堆肥中篩選具有較強纖維素降解能力菌株，采用纖維素剛果紅平板識別、濾紙崩解試驗初篩及液體發(fā)酵產(chǎn)酶復(fù)篩法得到2株產(chǎn)CMC酶活和FPA酶活較高菌株（枯草芽孢桿菌與隱球酵母菌），并以羧甲基纖維素鈉為主要碳源培養(yǎng)基研究其產(chǎn)酶性能，分類鑒定菌株，以期為秸稈快速腐解提供優(yōu)質(zhì)菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

牛糞和秸稈以質(zhì)量1∶1混合發(fā)酵堆肥，供試玉米秸稈和畜禽糞便均取自哈爾濱市周邊養(yǎng)殖戶。玉米秸稈經(jīng)曬干、粉碎，畜禽糞便為牛糞，曬干備用。

表1 堆肥物料基本化學性質(zhì)Table 1 Chemical properties of compost materials

1.2 方法

1.2.1 菌株分離與純化

取堆肥物10.0 g，無菌條件下加入裝90 mL無菌水搖瓶。置于搖床上，30℃下振蕩培養(yǎng)15 min。取上清液5 mL加入45 mL無菌水中，梯度稀釋成10-1至10-5濃度梯度，常規(guī)劃線法接種于NYD培養(yǎng)基[15]上，30℃恒溫培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)后分離平板菌落計數(shù)后挑選形態(tài)差異明顯菌落，重復(fù)劃線接種于培養(yǎng)基，直至純化得到單菌落。

1.2.2 纖維素降解菌初篩

采用剛果紅培養(yǎng)基[16]水解圈指標對純化菌株初篩[7]。30℃下于NYD培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h活化菌種，剛果紅培養(yǎng)基上點接菌株，經(jīng)3～4 d培養(yǎng)，分別測定水解圈直徑（D）和菌落直徑（d），計算D/d比值（即HC比值），挑取生長速度快且HC值較大菌株純化和保種，作為初篩菌株。

1.2.3 纖維素降解菌復(fù)篩

種子培養(yǎng)液配制：將菌種接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基[18]中，置于振蕩培養(yǎng)箱中30℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 d，制成種子培養(yǎng)液備用。

粗酶液制備：取3%種子培養(yǎng)液接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，三角瓶搖床培養(yǎng)，取定量培養(yǎng)液，4 000 r·min-1下離心20 min上清液即粗酶液，粗酶液應(yīng)馬上使用，若暫時不用置于4℃冰箱中冷藏，以免失活。

將初篩獲得菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，30℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)4 d，測其粗酶液CMC酶活和FPA酶活，選出酶活力高產(chǎn)菌株，作為復(fù)篩菌株。

1.2.4 酶活力測定

CMC酶活、FPA酶活測定分別參照文獻[19-20]方法。酶活按國際單位規(guī)定：每分鐘催化纖維素水解生成1 μmol葡萄糖酶量為一個酶活力，單位IU。

1.2.5 濾紙崩解試驗

移取5 mL粗酶液到濾紙條培養(yǎng)基[21]中，并以不加菌液濾紙條作為對照，在與初篩溫度相同條件下培養(yǎng)10 d，觀察濾紙條潰爛情況，以“+”表示濾紙崩潰程度，“+”越多說明該菌株纖維素降解能力越強[22]。將濾紙條用水輕輕沖洗，60℃烘干至恒重后稱重計算濾紙失重率[23]。

1.2.6 纖維素降解菌產(chǎn)酶條件研究

①培養(yǎng)時間對菌株酶活影響。在容積為150 mL三角瓶中，裝入50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，分別取3%1號和7號菌株種子培養(yǎng)液接種于其中，30℃下180 r·min-1搖振培養(yǎng)，分別于12、24、48、72、96、120、144 h取樣測定 CMC酶活和FPA酶活。

②調(diào)節(jié)初始液體發(fā)酵培養(yǎng)基pH，研究初始pH對菌株酶活影響[24]。在容積150 mL三角瓶中，分別裝入50 mL起始pH分別為4.0、4.5、5.5、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0液體發(fā)酵培養(yǎng)基，分別取3%1號和7號菌株種子培養(yǎng)液接種于不同pH液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃下180 r·min-1搖振培養(yǎng)48 h，取樣測定CMC酶活和FPA酶活。

1.3 纖維素分解菌鑒定

1.3.1 菌種形態(tài)觀察及生理生化特性

將所獲菌株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長狀況和菌落形態(tài)特征及革蘭氏染色表現(xiàn)，光學顯微鏡觀察。吲哚試驗、V-P試驗、淀粉水解、明膠水解等主要生理生化特征參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》[25]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[26]方法測定。

1.3.2 菌種分子生物學鑒定

采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株基因組DNA，使用引物7 F（5'CAGAGTT TGATCCTGGCT3'）和 1540 R（5'AGGAGGTGATCC AGCCGCA3'）對菌株16S rDNA序列擴增。酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)域基因序列分析以提取酵母菌總DNA為模板，用真菌26S rDNA D1/D2區(qū)通用引物 NL1（NL1∶5'GCATATCAATAAGCGGAAAAG3'）和NL4（5'GGTCCGTGTTTCAAGACG3'）作為上下游引物，擴增菌株26S rDNA D1/D2區(qū)域片段。PCR條件為：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，56℃退火45s，72℃延伸1min，72℃修復(fù)延伸10min，4℃保存。

獲得PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，將所得序列通過Blast程序和GenBank核酸數(shù)據(jù)在美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫比對分析，MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落統(tǒng)計及菌落形態(tài)描述

本試驗篩選10株菌落形態(tài)具有明顯特征菌株，觀察其菌落和菌種形態(tài)特征，描述菌落形態(tài)，結(jié)果見表2。

2.2 纖維素降解菌分離與篩選

將純化菌株轉(zhuǎn)接至剛果紅培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 d后測量透明圈直徑和菌落直徑見表3，由表3知，共4株菌產(chǎn)生較為清晰透明圈，選取HC（D/d）比值≥3菌株下一步篩選試驗。

2.3 初篩菌株濾紙條降解效果

將初篩菌株濾紙條降解試驗，結(jié)果見表4?？芍砑?號菌株濾紙潰爛成糊狀，濾紙條失重率為52.01%；添加1號菌株濾紙條接近糊狀，失重率為49.23%；添加2號和9號菌株濾紙條僅存在明顯彎曲現(xiàn)象，但未呈糊狀；3、4、5、8號菌株對濾紙條降解作用較小，濾紙未斷裂，僅邊緣出現(xiàn)毛邊；6號和10號對濾紙條基本不降解。因此，1

號和7號菌株對濾紙條降解能力較強。

表2 分離得到菌株菌落形態(tài)Table 2 Morphology of strains screened from enrichment cultivation

表3 纖維素降解菌透明圈直徑和菌落直徑Table 3 Diameters of transparent circles and colonies of strains

表4 纖維素降解菌對濾紙條降解結(jié)果Table 4 Filter paper degradation capacity of the celluloses degrading microbes

2.4 酶活力測定結(jié)果

將菌株置于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)2 d，設(shè)置3次重復(fù)，測定纖維素酶活和濾紙酶活，濾紙條降解效果、HC比值共同評價降解效果，復(fù)篩。最終得到2株CMC酶活和FPA酶活較高菌株（見圖1）。降解濾紙能力強菌株1號和7號CMC酶活和FPA酶活均較高，1號和7號菌株CMC酶活分別達26.82和31.28 U·mL-1，F(xiàn)PA酶活分別達20.32和30.82 U·mL-1，高于其他菌株。因此，將1號和7號菌株作為復(fù)篩菌，發(fā)酵產(chǎn)酶條件分析。

圖1 纖維素降解菌株酶活性Fig.1 Enzyme activities of celluloses degrading microbes

2.5 纖維素降解菌產(chǎn)酶條件

2.5.1 培養(yǎng)時間對菌株酶活力影響

由圖2可知，0～48 h內(nèi)，兩種酶活均隨培養(yǎng)時間增加而增加，在48～72 h內(nèi)，F(xiàn)PA酶活力輕微下降，但基本處于穩(wěn)定；而纖維素酶活迅速下降，說明培養(yǎng)時間對CMC酶活影響高于FPA酶活。因此，應(yīng)將48 h作為菌株最優(yōu)產(chǎn)酶時間。

2.5.2 培養(yǎng)基初始pH值對菌株產(chǎn)酶影響

培養(yǎng)基初始pH值對菌株產(chǎn)酶影響見圖3。

由圖3可知，當pH在4.0～10.0范圍時，CMC酶活和FPA酶活性隨pH增加迅速升高，至pH為6.0左右達到最大值；當pH 6.0～7.0之間時，酶活性基本穩(wěn)定；pH超過7.5時，酶活性開始逐漸降低，說明中性條件下，1號和7號菌株發(fā)酵產(chǎn)酶活力較高。因此，將pH為6.5作為最佳產(chǎn)酶pH。

2.6 纖維素降解菌分子生物學鑒定

2.6.1 16S rDNA鑒定

將測序在NCBI中比對，發(fā)現(xiàn)其與枯草芽孢桿菌屬（Bacillus subtilis）16S rDNA序列一致性高達100%。結(jié)合菌株形態(tài)學觀察、生理生化特征及掃描電鏡圖（見表5和圖4），可判定該菌是Bacillus subtilis。將所得全部序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，其登錄號為MF592134。通過CLustal W軟件作序列比較和MEGA 5.0軟件分析得到以16S rDNA序列為基礎(chǔ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖5）。結(jié)果表明1號菌株與Bacillus subtilis親緣關(guān)系較近。PCR產(chǎn)物片段經(jīng)電泳檢測（見圖8），圖中有明顯單一條帶，長度約為1 400 bp，與Bacillus subtilis片段長度一致。

圖2 培養(yǎng)時間對酶活性影響Fig.2 Effect of culture time on enzyme activities

圖3 pH對酶活性影響Fig.3 Effect of pH on enzyme activity

表5 1號菌株生理生化鑒定結(jié)果Table 5 Physiological and biochemical identification result of strain1

圖5 菌株1基于16S rDNA序列同源性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strains 1 based on 16S rDNA sequence homology

圖4 菌株1掃描電鏡圖Fig.4 SEM picture of strain 1

2.6.2 26S rDNA鑒定

將26S rDNA D1/D2區(qū)序列在NCBI中比對，發(fā)現(xiàn)與7號菌株相似性最高類群為隱球酵母菌（Cryptococcus flavescens），相似性達100%，該菌株在平板上菌株形態(tài)為圓形或者卵圓形，菌落為乳脂色、圓形、凸起、邊緣光滑，觀察掃描電鏡中菌落形態(tài)（見圖6）。

通過CLustal W軟件多序列比較和MEGA 5.0軟件分析得到以26S rDNA序列為基礎(chǔ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖7）。結(jié)果表明7號菌株與Cryptococcus flavescens親緣關(guān)系較近。將所得全部序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，其登錄號為MF620126（26S rDNA D1/D2序列）。以NL1和NL4作為上下游引物，擴增菌株26S rDNAD1/D2區(qū)域片段，片段長度在506 bp，電泳結(jié)果見圖6，圖中7號菌株片段長度與Cryptococcus flavescens一致。

圖6 菌株7掃描電鏡圖Fig.6 SEM picture of strain 7

圖7 菌株7基于26S rDNA序列同源性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of strains 7 based on 26S rDNA sequence homology

圖8 菌株Bacillus subtilis與Cryptococcus flavescens凝膠電泳Fig.8 Analysis of strain Bacillus subtilis and Cryptococcus flavescens fragment amplified by gel electrophoresis

3 討論

本試驗篩選菌株1號屬于芽胞桿菌屬，與枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）生理生化特征相似，其CMC酶活可達26.82 U·mL-1，F(xiàn)PA酶活可達20.32 U·mL-1。測定其生長特性，發(fā)現(xiàn)菌株1號最適生長pH為6.5，芽胞桿菌具有耐堿、耐酸、耐高溫等明顯優(yōu)勢，適應(yīng)環(huán)境能力很強，便于實際操作和工業(yè)生產(chǎn)[27-28]。李春鳳等研究表明，枯草芽孢桿菌生物同化作用較強，可有效降低糞便中吲哚、氨氣等有害氣體濃度，有利于糞便資源化利用[29]。

菌株7號屬于隱球酵母菌（Cryptococcus flavescens），其CMC酶活達31.28 U·mL-1，F(xiàn)PA酶活達30.82 U·mL-1。隱球酵母是一種用于采后保鮮的生防酵母菌[30]，具有拮抗效果好、抑菌譜廣、營養(yǎng)要求低、生長快、不產(chǎn)生毒素、對多數(shù)化學殺菌劑不敏感等特點[31]，可與多種化學及物理方法結(jié)合使用，防治果實采后病害[32]。目前，國內(nèi)堆肥發(fā)酵研究尚無有關(guān)隱球酵母對堆肥效果影響報道，該菌株對纖維素降解效果研究相對較少。

纖維素酶活力決定菌株對纖維素物質(zhì)分解能力。劉清鋒等對產(chǎn)纖維素酶菌株青霉T24-2優(yōu)化后，獲得最大濾紙酶活力和內(nèi)切酶活力分別為6.89、45.01 U·mL-1[33]；李保深等研究對秸稈降解效果較好的斜臥青霉產(chǎn)酶條件，28℃、120 r·min-1培養(yǎng)4 d，濾紙酶活力和內(nèi)切酶活力分別達7.085、3.856 IU·mL-1[34]。本試驗篩選出菌株1號和7號在30℃、pH 6.5培養(yǎng)48 h，F(xiàn)PA酶活和CMC酶活分別可達20.32、26.82 U·mL-1和30.82、31.28 U·mL-1，高于以上報道真菌和放線菌酶活力。說明2株細菌屬于高產(chǎn)優(yōu)良纖維素分解菌，有利于堆體中纖維素物質(zhì)降解。本試驗僅研究不同pH和培養(yǎng)時間條件下菌株產(chǎn)酶情況，由于酶產(chǎn)生和酶活力受諸多因素影響[35-36]，試驗菌株產(chǎn)酶條件有待進一步優(yōu)化。

4 結(jié)論

以剛果紅培養(yǎng)基和濾紙條降解試驗作為初篩，從中選出透明圈與菌落直徑比值較大、濾紙條分解能力較強菌株，并對其液體發(fā)酵培養(yǎng)，測定酶活力，得到CMC酶活和FPA酶活均較高2株菌——1號和7號。采用形態(tài)學、生理生化特征、16S rDNA及26S rDNA鑒定方法，初步確定1號菌屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），7號菌屬于隱球酵母菌（Cryptococcus flavescens）。

研究枯草芽孢桿菌與隱球酵母在羧甲基纖維素鈉為唯一碳源產(chǎn)酶培養(yǎng)基中產(chǎn)酶特性，結(jié)果表明，1號和7號在剛果紅培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后HC（D/d）比值為3.00、5.42，在pH 6.5，培養(yǎng)時間48 h條件下，1號和7號菌株CMC酶活達26.82和31.28 U·mL-1，F(xiàn)PA酶活達20.32和30.82 U·mL-1。

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