姜巨全，張正來，徐 桐，孟 琳

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

由于基因測序技術(shù)發(fā)展及其成本降低[1-2]，目前公布的全基因組菌株逐漸增多?；蚬δ茏⑨尣捎眯蛄型葱员葘Ψ椒ㄍ瓿蒣3]。該方法預(yù)測基因功能需相關(guān)試驗鑒定。盡管體外蛋白功能分析是最直接手段，但很多基因仍需體內(nèi)試驗驗證[4-5]。大腸桿菌缺失突變株功能互補被公認為體內(nèi)基因功能分析最快捷、有效的手段之一，即基因敲除構(gòu)建大腸桿菌目的基因缺失突變株，通過功能互補鑒定其他菌株相應(yīng)基因是否具有類似功能。此外，大腸桿菌缺失突變株還可通過功能互補，對不具有同源性但具有相同功能新基因甚至功能未知基因作功能分析。如常使用大腸桿菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn) 運 蛋 白 基 因 缺 陷 株 KNabc（ΔnhaA，ΔnhaB，ΔchaA）[4]和EP432（ΔnhaA，ΔnhaB）[5]通過功能互補法，初步分析基因功能，從中度嗜鹽菌[6-8]中篩選新型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因[9-10]。

在大腸桿菌（E.coli）K12中，僅dctA基因編碼1個有氧條件下負責(zé)攝取四碳-二羧酸的轉(zhuǎn)運蛋白[11]。該蛋白能否攝取四碳-2-羥基羧酸（如蘋果酸）未見報道。細菌中存在一類以Na+或H+作為共轉(zhuǎn)運陽離子驅(qū)動檸檬酸、蘋果酸或乳酸等2-羥基羧酸攝取的轉(zhuǎn)運蛋白（2-hydroxycarboxylic acid transporter，2-HCT）[12]。

作為四碳-2-羥基羧酸代表，蘋果酸常用作2-HCT轉(zhuǎn)運蛋白功能鑒定底物。如果大腸桿菌（E.coli）K12 dctA基因具有攝取蘋果酸功能，獲得該基因敲除突變株，對其他菌株來源2-HCT轉(zhuǎn)運蛋白基因克隆與功能分析具有重要意義。因此，本研究利用λ Red重組系統(tǒng)[13]，通過基因敲除構(gòu)建大腸桿菌四碳-二羧酸缺失突變株（E.coli ΔdctA），基于功能互補測試，鑒定DctA具有攝取蘋果酸功能。該基因敲除突變株構(gòu)建可為其他菌株來源2-HCT轉(zhuǎn)運蛋白基因克隆與功能鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

主要菌株、質(zhì)粒和引物如表1所示。

1.1.2 主要儀器

高速離心機（購自美國Thermo Scientific公司），超低溫冰箱（購自美國Thermo Scientific公司），培養(yǎng)箱（購自上海志成生物公司），水浴鍋（購自北京市永光明醫(yī)療儀器廠），電泳儀（購自北京六一生物科技有限公司），凝膠成像儀（購自美國SIM公司），pH計（購自德國Sartorius公司），高壓滅菌鍋（購自上海申安醫(yī)療器械廠），電轉(zhuǎn)儀（購自德國Eppendorf公司），PCR儀（購自德國Eppendorf公司），分光光度計（購自天津市普瑞斯儀器有限公司）等。

1.1.3 主要試劑

200 bp DNA Ladder、 1 kb DNA Ladder、 Marker IV、RNaseA核糖核酸酶、IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷））、X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）購自天根生物公司。Eco R I購自TaKaRa生物公司。瓊脂糖凝膠DNA膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司。ATP、EasypfuDNAPolymerase、dNTP、TaqDNAPolymerase、pEASY T3克隆試劑盒以及Trans1-T1感受態(tài)細胞購自北京全式金生物公司。氨芐青霉素、氯霉素、L-阿拉伯糖、L-蘋果酸和葡萄糖購自Biotopped公司。試驗所需引物合成與測序，均由北京華大基因公司完成。

1.1.5 培養(yǎng)基及誘導(dǎo)劑母液

LB培養(yǎng)基（1 L）：

胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，pH 7，定容至1 L。

M9培養(yǎng)基：

① 5×M9培養(yǎng)基母液（200 mL）：Na2HPO4·7H2O 12.8 g；NaCl 0.5 g；NH4Cl 1 g；KH2PO43 g，115℃滅菌30 min；

②含0.2%葡萄糖M9培養(yǎng)基（1 L）：5×M9鹽溶液200 mL；1 mol·L-1MgSO42 mL；1 mol·L-1CaCl20.1 mL；20%葡萄糖20 mL；無菌水定容至1 L。

③含0.2%蘋果酸M9培養(yǎng)基（1 L）：5×M9鹽溶液200 mL；1 mol·L-1MgSO42 mL；1 mol·L-1CaCl20.1 mL；20%蘋果酸20 mL；無菌水定容至1 L。

M9培養(yǎng)基配制過程中，MgSO4、CaCl2、葡萄糖、蘋果酸均溶解于ddH2O，使用0.22 μm濾膜過濾除菌。按需求向培養(yǎng)基中添加終濃度為50 μg· mL-1氨芐青霉素或25 μg· mL-1氯霉素。

L-阿拉伯糖母液（4 mol·L-1）：15.013 g·L-1阿拉伯糖溶解于ddH2O，定容至25 mL，使用0.22 μm濾膜過濾除菌。工作濃度為100 m·mol·L-1。

表1 菌株、質(zhì)粒和引物Table 1 Strains,plasmids and primers

1.2 方法

1.2.1 含氯霉素抗性基因（cmR）及dctA同源臂PCR擴增

以質(zhì)粒pKD3為模板，使用帶有50 nt的dctA敲除引物（ΔdctA-P1和ΔdctA-P2，見表1），對氯霉素抗性基因（cmR）作PCR擴增。引物設(shè)計原則為保證以上引物5'端分別引入50 nt dctA基因序列作為該基因同源臂（見表1）。擴增條件見表2，退火溫度為56℃，取1 μL PCR產(chǎn)物作0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測。該PCR產(chǎn)物即為含氯霉素抗性基因（cmR）及dctA同源臂目的片段。為驗證其正確性，在PCR產(chǎn)物末端加“A”，反應(yīng)體系為PCR產(chǎn)物中加入1 μL Taq DNA Polymerase、10×Buffer 5 μL 和 dNTP 4 μL，72 ℃擴增60 min。膠回收PCR產(chǎn)物2～4 μL，與0.5 μL pEASY T3載體混勻，室溫放置約20 min，轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細胞，在含有Amp50和Cm25LB平板上作藍白斑篩選，質(zhì)粒提取后經(jīng)酶切鑒定正確，送華大基因公司測序鑒定PCR產(chǎn)物。

表2 含cmR基因及dctA同源臂PCR擴增反應(yīng)體系Table 2 PCR reaction system of cmRgene fragment flanked by dctA homologous arms

1.2.2 λ Red重組系統(tǒng)誘導(dǎo)表達及其電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞制備

將pKD46首先采用CaCl2法[14]化轉(zhuǎn)大腸桿菌（E.coli）K12感受態(tài)細胞，挑取單菌落，接種于Amp505 mL LB液體培養(yǎng)基中，30℃，160 r·min-1過夜培養(yǎng)。以1%接種量轉(zhuǎn)接于100 mL含Amp50的新鮮LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)約2 h至OD600nm0.2～0.3；加入過濾滅菌L-阿拉伯糖（終濃度100 m·mol·L-1），30℃，160 r· min-1誘導(dǎo)培養(yǎng)1.5～2 h，至OD600nm約0.8時停止培養(yǎng)，立即冰浴20 min；分裝菌液于預(yù)冷離心管中，離心收集菌體，無菌去離子水重懸洗滌1次；再用冰冷的10%甘油（去離子水配制）重懸、洗滌

2次；適量預(yù)冷10%甘油重懸收集菌體（比例為100 mL菌液：1 mL 10%甘油），按每管100 μL分裝，直接用于電轉(zhuǎn)化（離心參數(shù)為4℃，5 000 r·min-1和10min）。

1.2.3 含氯霉素抗性基因（cmR）及dctA同源臂電轉(zhuǎn)化

將含氯霉素抗性基因（cmR）及dctA同源臂PCR產(chǎn)物（約400 ng）加入新制備100 μL感受態(tài)細胞中，混勻，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷0.1 cm電轉(zhuǎn)杯中，BioRad電轉(zhuǎn)儀作電轉(zhuǎn)化（條件為：電壓2 500 kV，時間4～5 ms）。電轉(zhuǎn)后立即加入900 μL液體LB培養(yǎng)基復(fù)蘇，混勻后轉(zhuǎn)入無菌1.5 mL離心管中，37℃，160 r·min-1復(fù)蘇1 h。然后，室溫放置約12 h涂布于含25 μg·mL-1氯霉素LB平板上37℃培養(yǎng)16～24 h，直至菌落出現(xiàn)。

1.2.4 dctA基因敲除與驗證

將氯霉素抗性平板長出單菌接種于含25 μg·mL-1氯霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)。以上述菌液為模板（以E.coli K12/pKD46菌液作為負對照），使用ΔdctA驗證引物（ΔdctA-VF和ΔdctAVR，見表1），作PCR擴增。擴增條件如表2所示，其中退火溫度為56℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，送北京華大基因公司測序鑒定基因敲除是否正確。

1.2.5 質(zhì)粒pKD46消除與驗證

質(zhì)粒pKD46復(fù)制起點對溫度敏感，該質(zhì)?？稍?7℃條件下正常復(fù)制，但42℃無法復(fù)制。為消除pKD46，將以上重組菌株劃線于無抗生素LB平板，經(jīng)42℃過夜培養(yǎng)后，牙簽挑取單菌落分別于含有Cm25和Amp50液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)約12 h，觀察生長情況。如果菌株在Amp50液體LB培養(yǎng)基生長，則重復(fù)以上步驟，直至Amp50液體LB培養(yǎng)基不再生長，暗示質(zhì)粒pKD46已消除。在確定單菌落無法生長基礎(chǔ)上，以質(zhì)粒pKD46為對照，使用pKD46驗證引物（pKD46-VF和pKD46-VR，見表1）對以上單菌落作PCR驗證。擴增條件見表2，其中退火溫度為55℃。

1.2.6 dctA基因克隆與載體構(gòu)建

以大腸桿菌（E.coli）K12基因組為模板，使用dctA克隆引物（dctA-CF和dctA-CR，見表1），對dctA基因及上游啟動子和核糖體結(jié)合位點作PCR擴增，擴增條件如表1所示，其中退火溫度為55℃，取1 μL PCR產(chǎn)物作0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物末端加“A”、構(gòu)建載體等同1.2.1方法所述。在含Amp50的LB固體培養(yǎng)基中藍白斑篩選，質(zhì)粒提取后經(jīng)酶切鑒定正確，送測序鑒定載體構(gòu)建是否正確。

1.2.7 蘋果酸攝取功能互補測試

將野生型大腸桿菌（E.coli）K12及其基因敲除突變株，經(jīng)LB培養(yǎng)基活化，以1%接種量轉(zhuǎn)接于含0.2%葡萄糖作為唯一碳源M9液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至適宜OD600nm，去除LB培養(yǎng)基中痕量蘋果酸；轉(zhuǎn)接含0.2%蘋果酸作為唯一碳源M9液體培養(yǎng)基，37℃、140 r·min-1培養(yǎng)72 h，繪制測試菌株生長曲線；基于以上結(jié)果，選取適宜生長時間，測試所有受試菌株OD600nm，驗證受試菌株是否具有攝取蘋果酸功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 dctA基因敲除片段制備

為敲除大腸桿菌（E.coli）K12的dctA基因，采用1.2.1方法制備該基因敲除線性片段。在PCR擴增氯霉素抗性基因同時，引入50 nt dctA基因同源臂用于后續(xù)基因同源重組（原理見圖1）。最終獲得PCR產(chǎn)物長度為1 115 bp（見圖2A）。該PCR產(chǎn)物即為dctA基因敲除線性片段，命名為ΔdctA-P1-CmR-ΔdctA-P2。為驗證PCR產(chǎn)物正確性，將部分該PCR產(chǎn)物構(gòu)建到pEasy T3。獲得重組載體pEasy T3-ΔdctA經(jīng)酶切驗證（見圖2B）正確后，進一步測序證明ΔdctA-P1-CmR-ΔdctA-P2制備成功。

圖1 λ Red同源重組示意圖Fig.1 λ Red homologous recombination diagram

2.2 重組菌株E.coli ΔdctA/pKD46構(gòu)建與驗證

為構(gòu)建dctA基因敲除突變株，將攜帶λ Red重組系統(tǒng)的pKD46化轉(zhuǎn)大腸桿菌（E.coli）K12，誘導(dǎo)λ Red重組系統(tǒng)表達，制備E.coli K12/pKD46電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞；采用1.2.3方法將上述制備dctA基因敲除線性片段（ΔdctA-P1-CmR-ΔdctA-P2）電轉(zhuǎn)化至E.coli K12/pKD46感受態(tài)細胞中，誘導(dǎo)ΔdctA-P1-CmR-ΔdctA-P2與野生型E.coli K12 dctA基因同源重組。隨機挑取3個單菌落，采用1.2.4方法以E.coli K12/pKD46菌液作負對照，對以上3個單菌落PCR擴增，驗證是否獲得突變株E.coli ΔdctA。確定以上單菌落PCR產(chǎn)物小于E.coli K12/pKD46菌液PCR產(chǎn)物（見圖3A）后，選取其一經(jīng)測序，大腸桿菌（E.coli）K12基因組dctA基因已被ΔdctA-P1-CmR-ΔdctA-P2替代。表明dctA基因已成功敲除，該重組菌株命名為E.coli ΔdctA/pKD46。

圖2 PCR擴增dctA基因敲除線性片段Fig.2 PCR amplification of linear fragment for knock-out of dctA gene

2.3 基因敲除突變株E.coli ΔdctA構(gòu)建

為構(gòu)建基因敲除突變株E.coli ΔdctA，需消除重組菌株E.coli ΔdctA/pKD46中質(zhì)粒pKD46。因此，從雙抗（Cm25和Amp50）LB平板挑取2個單菌落，采用1.2.5方法反復(fù)轉(zhuǎn)接于無抗生素的LB固體平板，經(jīng)42℃過夜培養(yǎng)后，最終在含Amp50液體LB培養(yǎng)基均不再生長，表明質(zhì)粒pKD46已消除。在此基礎(chǔ)上，以質(zhì)粒pKD46為對照，經(jīng)PCR驗證，以上2個菌落無特征條帶，表明質(zhì)粒pKD46已消除（見圖3B）。選取其一作為dctA基因敲除突變株用于后續(xù)功能驗證，命名為E.coli ΔdctA。

2.4 dctA基因克隆及其表達載體構(gòu)建

為進一步驗證E.coli ΔdctA構(gòu)建及DctA攝取蘋果酸功能，需要構(gòu)建pEasy T3-dctA表達載體。首先對dctA基因及上游啟動子和核糖體結(jié)合位點（1 660 bp）作PCR擴增，PCR產(chǎn)物約為1.6 kb（見圖4A），與實際大小基本一致。將PCR產(chǎn)物構(gòu)建到pEasy T3，提取質(zhì)粒經(jīng)酶切驗證（見圖4B）后，測序結(jié)果表明pEasy T3-dctA表達載體構(gòu)建成功。將pEasy T3-dctA（pEasy T3為負對照）轉(zhuǎn)化E.coli ΔdctA感受態(tài)細胞，獲得陽性克隆分別命名為E.coli ΔdctA/pEasy T3-dctA和E.coli ΔdctA/pEasy T3。

圖3 基因敲除突變株E.coli ΔdctAPCR驗證Fig.3 Verification of E.coli ΔdctA by PCR

圖4 pEasy T3-dctA重組載體構(gòu)建Fig.4 Construction of recombinant plasmid pEasy T3-dctA

2.5 E.coli ΔdctA蘋果酸攝取功能互補測試

圖5 基因敲除菌株E.coli ΔdctA功能互補試驗Fig.5 Functional complementary experiment of E.coli ΔdctA

為測試基因敲除菌株E.coli ΔdctA蘋果酸攝取功能，首先在以0.2%葡萄糖或0.2%蘋果酸作為唯一碳源M9固體平板測試E.coli K12和E.coli ΔdctA生長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E.coli K12在以上兩種碳源M9固體平板均正常生長，相比之下，E.coli ΔdctA無法在以0.2%蘋果酸作為唯一碳源M9固體平板生長（見圖5A）。進一步測試E.coli ΔdctA轉(zhuǎn)化子生長情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E.coli ΔdctA/pEasy T3-dctA在以上兩種碳源M9固體平板均正常生長，相比之下，E.coli ΔdctA/pEasy T3（空載體作為負對照）無法在以0.2%蘋果酸作為唯一碳源M9固體平板生長（見圖5B）。在此基礎(chǔ)上，繪制野生型E.coli K12和E.coli ΔdctA在以0.2%蘋果酸作為唯一碳源M9液體培養(yǎng)基中生長曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，24 h內(nèi)，E.coli K12生長達到穩(wěn)定期，基因敲除菌株E.coli ΔdctA無法生長（見圖5C）。因此，24 h為受試菌株培養(yǎng)時間。采用同樣方法，測試24h內(nèi)E.coliK12（正對照）、E.coliΔdctA（菌株作為負對照）、E.coli ΔdctA/pEasy T3（空載體作為負對照）和E.coli ΔdctA/pEasy T3-dctA在以0.2%蘋果酸作為唯一碳源M9液體培養(yǎng)基中生長情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在以0.2%蘋果酸作為唯一碳源M9液體培養(yǎng)dctA均正常生長，E.coli ΔdctA（菌株作為負對照）和E.coli ΔdctA/pEasy T3（空載體作為負對照）均無法生長（見圖5D）。以上結(jié)果表明，E.coli ΔdctA喪失蘋果酸攝取功能，即基因敲除菌株E.coli ΔdctA構(gòu)建成功。四碳-二羧酸攝取蛋白DctA具有攝取蘋果酸功能。

3 討論與結(jié)論

在無氧條件下，大腸桿菌（E.coli）對四碳-二羧酸和L-天冬氨酸攝取、交換和外排由三個獨立二羧酸攝取（Dcu）系統(tǒng)介導(dǎo)：DcuA，DcuB和DcuC[15-16]。但在有氧條件下，大腸桿菌（E.coli）攝取四碳-二羧酸由DctA介導(dǎo)[17]。DctA由電化學(xué)質(zhì)子梯度提供驅(qū)動力，其活性受琥珀酸鹽誘導(dǎo)及分解代謝物抑制[17]。DctA能否攝取四碳-2-羥基羧酸（如蘋果酸）國內(nèi)仍未見報道。本研究利用λ Red同源重組系統(tǒng)對野生型大腸桿菌（E.coli）K12 dctA作基因敲除，成功構(gòu)建突變株E.coli ΔdctA。在含有以0.2%蘋果酸為唯一碳源M9培養(yǎng)基中，通過功能互補測試證明E.coli ΔdctA喪失攝取蘋果酸功能，四碳-二羧酸攝取蛋白DctA具有攝取蘋果酸功能。

λ Red重組系統(tǒng)可實現(xiàn)基因靶向敲除，由gam，bet和exo三個基因編碼。gam基因編碼Gam蛋白，抑制大腸桿菌RecBCD蛋白復(fù)合體核酸外切酶活性，防止線性DNA片段被降解[18]。bet基因編碼Beta蛋白是一個DNA單鏈結(jié)合蛋白，可與DNA單鏈結(jié)合促進互補鏈退火形成新雙鏈分子，是一種重組蛋白[19]。exo基因編碼Exo蛋白[20]，其活性形式為一個環(huán)狀三聚體，使環(huán)狀相連三個單體分子內(nèi)部形成通道，通道一端可容納雙鏈DNA分子，另一端僅可容納單鏈DNA。Beta蛋白和Exo蛋白共同作用下完成線性DNA重組，最終實現(xiàn)基因敲除。本研究通過λ Red重組系統(tǒng)成功構(gòu)建大腸桿菌K12 dctA基因敲除突變株E.coli ΔdctA，證明該方法敲除大腸桿菌基因方面應(yīng)用可靠性較高，基因敲除突變株E.coli ΔdctA構(gòu)建可為其他菌株來源2-HCT轉(zhuǎn)運蛋白基因克隆與功能鑒定奠定基礎(chǔ)。

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