楊紅艷，龔韋凡，李竣，張華林

（1.嶺南師范學院化學化工學院，廣東湛江 524048）（2.中南民族大學藥學院，湖北武漢 430074）

抑郁癥（depression）是一組以顯著而持久的心境低落為主要特征的綜合癥，是常見精神疾病之一。世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計表明，世界上前10種致人殘疾或喪失勞動能力的疾病中，抑郁癥居第5位，并且具有逐步上升的趨勢。三七葉總皂苷為五加科（Araliaceae）植物三七Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen莖葉的提取物，是傳統(tǒng)中成藥七葉神安片的主要原料，具有益氣安神、活血止痛的功效，臨床用于心氣不足、心血瘀阻所致的心悸、失眠、胸痛和胸悶等。三七葉總皂苷和來源于三七根莖的三七總皂苷一樣含有豐富的人參皂苷成分，不同的是前者主要含 20(S)-原人參二醇（PPD）型人參皂苷，幾乎不含 20(S)-原人參三醇（PPT）型人參皂苷[1]。

我們從三七葉總皂苷中進一步的分離、精制獲得具有良好抗抑郁活性的三七葉總皂苷提取物，其作用機制涉及五羥色胺能系統(tǒng)（5-HT）、去甲腎上腺素能系統(tǒng)（NE）以及多巴胺能系統(tǒng)（DA）等三種神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)[2]。進一步的分子作用機制研究表明，該提取物的抗抑郁作用也與 cAMP反應元件結(jié)合蛋白（CREB）及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）這兩種與抑郁癥相關(guān)的神經(jīng)調(diào)節(jié)因子以及cAMP-PKA-CREB-BDNF、TrKB-ERK-CREB-BDNF這兩條上游神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導通道有密切關(guān)聯(lián)[3,4]。

此外我們從總提取物、有效組分、有效成分三個層面進行藥效評價，分析其起效的物質(zhì)基礎(chǔ)，結(jié)果表明以人參皂苷Rb3、Rb1、Rb2、Rc和三七皂苷Fc等為代表的PPD型人參皂苷是重要的活性成分[5,6]。

本文針對PPD型人參皂苷成分，采用高效液相色譜法對抗抑郁三七葉總皂苷提取物的成分進行初步的定性分析，并對Rb1、Rc、Fc、Rb2和Rb3這5種活性成分同時進行含量測定，為該活性提取物建立質(zhì)量標準提供依據(jù)，為研發(fā)抗抑郁中藥新藥打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與原料

三七葉總皂苷由本實驗室制備，人參皂苷Rb1(批號：GR-134-170304)，人參皂苷 Rb2(批號：GR-133-161129)，人參皂苷Rb3(批號：GR-133-161226)，人參皂苷Rc(批號：GR-134-170107)，三七皂苷Fc(批號：GR-134-170409)以及三七皂苷R1、Fa、Fe，人參皂苷Rg1、Rd、F1、C-K、Rh2、Rg3，原人參二醇等對照品均購自南京澤朗醫(yī)藥有限公司；色譜甲醇、乙腈購自美國Tedia公司；其他試劑為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；Milli-Q plus system超純水儀，美國Millipore，Milford，MA；KQ-500E型超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司；AL204電子天平，瑞士 MettlerToledo公司；DK-8B型電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 三七葉總皂苷成分定性分析

色譜條件：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）:0.2%磷酸溶液（B），線性梯度洗脫（V/V），洗脫時間程序見表1，流速0.3 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長為203 nm，進樣量為10 μL。樣品溶液制備：精密稱取三七葉總皂苷樣品適量，置于10 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲溶解，放置室溫，定容，搖勻后用0.45 μm微孔濾膜過濾，棄初濾液，取續(xù)濾液進樣。

表1 梯度洗脫時間程序Table 1 Time program of gradient elution

1.2.2 人參皂苷 Rb1、Rb2、Rc、Rb3與三七皂苷Fc的含量測定

色譜條件：Agela Venusil XBP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇:0.2%磷酸溶液（70:30），等度洗脫，流速為0.8 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為203 nm，進樣量為10 μL。

系列濃度對照品溶液的制備：精密稱取Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得對照品儲備液。將對照品儲備液逐步稀釋，得到系列濃度的對照品溶液。

樣品溶液制備：精密稱取三七總皂苷樣品適量，置于10 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲溶解，放置室溫，定容，搖勻后用0.45 μm微孔濾膜過濾，棄初濾液，取續(xù)濾液進樣。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析與處理

人參皂苷成分定性分析研究，采用對照品對照并結(jié)合相關(guān)文獻[7]進行高效液相色譜圖分析，確定色譜峰的歸屬。

含量測定實驗線性方程采用SPSS 17.0完成，其他數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 三七葉總皂苷成分定性分析結(jié)果

三七葉總皂苷的HPLC圖譜（見圖1），共標定色譜峰36個。對色譜峰進行定性分析，結(jié)果見表2。

圖1 三七葉總皂苷HPLC分析圖譜Fig.1 HPLC analysis of total saponins from the leaves of Panax Notoginseng

2.2 人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rb3與三七皂苷Fc的含量

2.2.1 色譜條件的確定及系統(tǒng)適應性試驗

Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3均為帶4～5 個糖基的PPD型人參皂苷，化學性質(zhì)較為接近，給色譜分離帶來困難，故文獻采用梯度洗脫的方法，但是會出現(xiàn)一定的基線漂移的現(xiàn)象[8]。實驗中選擇以等度洗脫為基礎(chǔ)，對不同流動相體系（甲醇:0.2%磷酸溶液，乙腈:水，乙腈:磷酸溶液，甲醇:水，甲醇:磷酸溶液，乙腈:甲醇:水等），不同色譜柱（Agela Venusil XBP C18、Agilent ZORBAX SB-C18、Ultimate AQ-C18、Inertsil ODS-3、Eclipse XDB-C18-USP L1、Diamonsil C18等）以及不同的柱溫條件（35、30、25、20 ℃）的分離效果進行比較，最后確定采用Agela Venusil XBP C18色譜柱，柱溫為30 ℃，甲醇-0.2%磷酸溶液（70:30）等度洗脫，徹底解決了基線漂移的問題，而且能夠使Rb1、Rc、Rb2、Fc、Rb3這5種成分達到良好分離，分離度均大于1.5，色譜圖見圖2。

圖2 混合對照品（a）、三七葉總皂苷（b）的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed reference substance (A),total saponins from the leaves of Panax Notoginseng (B)

2.2.2 線性關(guān)系

取系列濃度對照品溶液，按照1.2.2項下色譜條件測定，記錄各成分的峰面積。以峰面積A和對照品濃度C(mg/mL)作線性回歸，得到線性方程，結(jié)果見表3。

表2 三七葉總皂苷HPLC成分分析結(jié)果Table 2 HPLC analysis of the components of total saponins from the leaves of Panax Notoginseng

12 人參皂苷F1 42.573 30 人參皂苷C-K 117.633 13 三七皂苷Fe 46.28 31 人參皂苷Rh2 121.27 14 51.567 32 122.657 15 54.94 33 134.757 16 57.073 34 原人參二醇 137.467 17 74.167 35 145.077 18 77.537 36 147.77

表3 人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3與三七皂苷Fc的線性方程Table 3 Linear equations of ginsenosides Rb1, Rc, Rb2, Rb3 and notoginsenoside Fc

2.2.3 精密度試驗

取系列濃度對照品溶液中的任意一份，連續(xù)進樣5次，測定各成分的峰面積，分別計算RSD值。結(jié)果Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3的RSD值分別為0.64%、1.07%、0.53%、1.69%和1.49%，表明儀器的精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗

精密稱取三七總皂苷，按照1.2.2項下操作，制備樣品溶液，分別在0，4，8，12，24，36，48 h內(nèi)進樣，測定各成分的峰面積，分別計算 RSD值。結(jié)果Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3的RSD值分別為1.95%、1.57%、1.41%、1.85%、1.25%，表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 重現(xiàn)性試驗

精密稱取三七葉總皂苷，按照1.2.2項下操作，平行制備6份樣品溶液，分別進樣，測定各成分的峰面積，分別計算RSD值。結(jié)果Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3的RSD值分別為1.85%、1.15%、1.06%、1.22%、0.73%，表明該含量測定方法重現(xiàn)性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量三七總皂苷樣品適量，根據(jù)樣品中所含Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3含量的50%、100%、150%，加入各對照品，按照“2.2.3”樣品溶液制備項下操作，平行制備9份樣品溶液，進樣，測定各成分的峰面積，計算加樣回收率及RSD值，結(jié)果見表4，平均回收率均在99%～101%之間，表明該含量測定方法對于5種成分的準確度較高。

2.2.7 樣品測定

按照 1.2.2樣品溶液制備項下操作，平行制備 6份樣品溶液，測定抗抑郁三七葉總皂苷的主要成分Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3的含量，結(jié)果見表 5。

表4 加樣回收率試驗結(jié)果Table 4 Results of recovery tests

人參皂苷Rc 0.98 0.49 1.48 102.04 99.51±1.33 1.34 1.46 97.96 1.46 97.96 0.98 1.96 100.00 1.96 100.00 1.95 98.98 1.47 2.43 98.64 2.44 99.32 2.46 100.68三七皂苷Fc 0.80 0.40 1.20 100.00 100.09±1.45 1.45 1.22 102.50 1.21 102.50 0.80 1.59 98.75 1.60 100.00 1.59 98.75 1.20 2.00 100.00 1.99 99.17 1.99 99.17人參皂苷Rb2 0.28 0.14 0.41 100.00 100.53±2.24 2.22 0.42 100.00 0.42 100.00 0.28 0.57 103.57 0.57 103.57 0.56 100.00 0.42 0.69 97.62 0.69 97.62 0.71 102.38人參皂苷Rb3 1.56 0.78 2.33 98.72 100.12±1.74 1.74 2.35 101.28 2.33 98.72 1.56 3.11 99.36 3.12 100.00 3.12 100.00 2.34 3.88 99.15 3.89 99.57 4 104.27

表5 三七葉總皂苷5種人參皂苷的含量測定結(jié)果（%）Table 5 Content determination of five ginsenosides in total saponins from the leaves of Panax Notoginseng (%)

5 2.41 9.88 7.84 2.85 15.90 38.88 6 2.32 9.85 8.06 2.84 15.81 38.88平均 2.37±0.04 9.78±0.10 7.94±0.08 2.85±0.34 15.73±0.11 38.67±0.18

3 結(jié)論

3.1 本課題對抗抑郁作用三七葉總皂苷提取物進行初步的成分分析，從中鑒定出 Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3等15種人參皂苷成分，其中13種為PPD型人參皂苷。對其中的Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3這5種代表性PPD型人參皂苷活性成分同時進行含量測定，總含量高達 38.67±0.18%。上述結(jié)果表明該活性提取物主要以PPD型人參皂苷為主。我們之前的實驗使用硅膠柱層析技術(shù)將三七葉總皂苷按照極性的大小切割成三個部位，同時進行抗抑郁活性的對比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)富含Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3的部位活性最強，我們也單獨分析了Rb3、Rb1、Rb2等化合物的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述化合物，尤其是三七葉總皂苷里面含量最高的Rb3(＞10%)具有明顯的抗抑郁作用[5,6]。此外其它的文獻也報道了Rb3、Rb1、Rc等PPD型化合物的抗抑郁活性[9,10]。我們推測Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3等PPD型人參皂苷成分是三七葉總皂苷抗抑郁作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，應該是多成分協(xié)同整合共同發(fā)揮抗抑郁作用。

3.2 本研究采用HPLC法對Rb1、Rc、Fc、Rb2、Rb3這5種代表性活性成分同時進行含量測定，該方法準確可靠，可用于抗抑郁作用三七葉總皂苷提取物的質(zhì)量控制。然而三七葉總皂苷中還有若干的未知成分需要采用HPLC-ESI-MS等方法進一步確定。

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