管錦繡，翁文川，許喜林，凌莉，冼鈺茵，易蓉，李志勇

（1. 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東廣州 510623）

諾如病毒(Norovirus，NoV)是引發(fā)世界范圍內(nèi)非細菌性急性胃腸炎的主要致病原之一。諾如病毒屬于人類杯狀病毒科，呈球形，無包膜[1]，直徑27～35 nm，基因組是一條長達7.5～7.7 kb的單股正鏈RNA，包含3個開放閱讀框，分別編碼高度保守的非結(jié)構(gòu)蛋白，主要結(jié)構(gòu)衣殼蛋白VP1和次級衣殼蛋白VP2[2]。根據(jù)諾如病毒聚合酶和衣殼蛋白編碼區(qū)核苷酸和氨基酸序列特征，諾如病毒分為5個基因型[3]。人群致病諾如病毒大致分為GⅠ、GⅡ、GⅣ3個基因型，其中統(tǒng)計表明當(dāng)屬 GⅡ型諾如病毒最為高發(fā)[1]。諾如病毒有很強的感染力和致病力，在人口聚集的場所極易引起暴發(fā)，被喻為“腸道流感”[5]。該病毒的傳播途徑類似于甲肝病毒，主要是通過人-人接觸和污染的食品及水源傳播[6]，諾如病毒可以存活在被污染的食品表面數(shù)日或數(shù)周內(nèi)都具有感染性[7]。在全球都有其流行擴散的報道，諾如病毒引起每年美國 2300萬胃腸炎病例，95%的急性病毒性胃腸炎暴發(fā)由諾如病毒引起[8]，國內(nèi)由諾如病毒引起的急性胃腸炎疫情的報道逐漸增多，日益成為重要的公共衛(wèi)生問題[9]。

由于GⅡ諾如病毒尚不能進行體外培養(yǎng)，也缺乏相應(yīng)的動物模型，變異多，鑒別和檢測非常困難。傳統(tǒng)的免疫學(xué)及血清學(xué)檢測方法存在很大的局限性。隨著大量諾如病毒全基因及部分序列的測定與分析，分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于其診斷和研究[9]。目前諾如病毒的檢測大多使用實時熒光RT-PCR（RT-qPCR）方法。但RT-qPCR法需要制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，且在靈敏度方面有一定的局限性。微滴數(shù)字 RT-PCR(Reverse Transcription Droplet Digital PCR，RT-ddPCR)是近年來興起的一種新的絕對定量的技術(shù)，又稱為第三代PCR技術(shù)。微滴數(shù)字RT-PCR法與實時熒光RT-PCR法相比，具有更高的靈敏度，并且它不需要依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，能夠?qū)崿F(xiàn)絕對定量，無疑是理想的選擇。

本研究對 RT-ddPCR反應(yīng)的退火溫度進行了優(yōu)化，對RT-qPCR法和RT-ddPCR法檢測GⅡ型諾如病毒的靈敏度及重現(xiàn)性進行了比較，并將優(yōu)化后的RT-ddPCR法初步應(yīng)用于人工污染樣品西生菜的檢測，建立了快速準(zhǔn)確的GⅡ型諾如病毒定量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料

GⅡ型諾如病毒陽性樣品懸液由丹東出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心提供；西生菜采集于廣州市各區(qū)農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.2 主要試劑

配制溶液：牛肉膏-甘氨酸洗脫液（含3%牛肉膏，0.05 mol/L甘氨酸，pH 9.5）、PEG6000+PEG8000溶液（含20%（m/V）PEG6000，20%（m/V）PEG8000，1.5 mol/L氯化鈉）。

購置試劑：PBS緩沖液，美國GE Healthcare Life Sciences公司；PEG8000和PEG6000分析純，上海生工公司；甘氨酸分析純，廣州化學(xué)試劑廠；牛肉浸膏，廣東環(huán)凱生物科技有限公司；QIAamp Viral RNA mini Kit，德國 QIAGEN 公司；One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)（貨號：RR064A），寶生物工程(大連)有限公司；One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for ProbesNo dUTP(貨號：1864021)，美國伯樂公司；微滴式數(shù)字PCR其他有關(guān)試劑，美國伯樂公司。

1.1.3 儀器

pH計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；GFL1013恒溫水浴鍋，德國GFL公司；E163302生物安全柜，賽默飛公司；Sigma1-15PK高速冷凍離心機，美國Sigma公司；Sigma1-14小型高速離心機，美國Sigma公司；MDF-382E(N)-70 ℃冰箱，日本 Sanyo公司；ABI 7900HT Fast型實時熒光PCR儀，美國ABI公司；BSA3202S電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；VORTEX GENE-2G560E渦旋震蕩器，美國Scientific Industries公司；HVE-50高壓滅菌鍋，華粵行儀器有限公司；QX200 Droplet Reader、DG8 cartridge微滴生成卡、QX200 Droplet Generator、PX1TM PCR Plate Sealer和PCR基因擴增循環(huán)儀，美國伯樂公司。

1.1.4 引物和探針

選取檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T 1635-2005 貝類中諾沃克病毒檢測方法 普通 RT-PCR 方法和實時熒光RT-PCR 方法）中引物和探針研究GⅡ型諾如病毒，用于實時熒光 RT-PCR（RT-qPCR）法和微滴式數(shù)字RT-PCR（RT-ddPCR）法檢測。引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成(表1)。

表1 檢測GⅡ型諾如病毒所用引物探針序列Table 1 The primers and probe for the detection of GⅡ Norovirus

1.2 方法

1.2.1 RNA提取

取140 μL GⅡ型諾如病毒陽性樣品懸液于1.5 mL離心管中，按照QIAamp Viral RNA mini Kit說明書操作進行病毒RNA的提取。將提取的RNA進行10倍梯度稀釋，然后-80 ℃凍存或者直接進行RT-qPCR和RT-ddPCR反應(yīng)。

1.2.2 實時熒光RT-PCR反應(yīng)

以1.2.1制備的RNA為模板，使用的引物和探針序列見表1，進行RT-qPCR反應(yīng)。RT-qPCR反應(yīng)體系（20 μL）：Buffer 10 μL，Taq HS 0.4 μL，RT Enzyme Mix 0.4 μL，上引物 COG2F 0.8 μL（10 μmol/L），下引物 COG2R 0.8 μL（10 μmol/L），探針 Probe Ring2-TP 0.8 μL（10 μmol/L），ROX 0.4 μL，RNA 模板 2 μL，RNase-free Water 4.4 μL。反應(yīng)條件設(shè)置為：42 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，56 ℃ 1 min，共 45 個循環(huán)。

1.2.3 微滴式數(shù)字RT-PCR反應(yīng)

采用One-step RT-ddRT-PCR Kit for Probes試劑盒推薦的20 μL體系，以1.2.1制備的RNA為模板，使用的引物和探針序列見表1，進行RT-ddPCR反應(yīng)。RT-ddPCR反應(yīng)盡量在封好膜之后30 min內(nèi)進行或者放于4 ℃冰箱4 h之內(nèi)進行。RT-ddPCR反應(yīng)體系（20 μL）：Supermix 5 μL，Reverse transcriptase 2 μL，300 Mm DTT 1 μL，上引物 COG2F 1.8 μL（10 μmol/L），下引物 COG2R 1.8 μL（10 μmol/L），探針 Probe Ring2-TP 0.5 μL（10 μmol/L），RNA 模板 2 μL，RNase-free Water 5.9 μL。反應(yīng)條件設(shè)置為：42 ℃ 60 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，共 40 個循環(huán)；98 ℃ 10 min；4 ℃ ∞。RT-ddPCR反應(yīng)結(jié)束后將96孔板放入QX200 Droplet Reader，依次錄入樣品信息后運行，儀器自動采集熒光信號，完畢后采用軟件Quanta Soft計算出最終結(jié)果。

1.2.4 人工污染樣品檢測

將西生菜葉片剪成1 cm×cm片狀，稱取5.0 g放入50 mL離心管中。將GⅡ型諾如病毒陽性樣品懸液10倍稀釋，稀釋度為10-1～10-5，然后分別取不同稀釋度的GⅡ型諾如病毒稀釋液200 μL加入到裝有西生菜葉片的50 mL離心管中，生物安全柜室溫靜置20 min制得人工污染樣品。然后加入40 mL牛肉膏-甘氨酸洗脫液，37 ℃ 100 r/ min孵育30 min，4 ℃，10000 r/min離心30 min；轉(zhuǎn)移上清至另一個50 mL離心管中，用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.0±0.5；加入等體積同濃度（40%）的PEG6000+PEG8000，使沉淀劑終濃度為8%，渦旋振蕩60 s混勻；在4 ℃下孵育4 h。5 ℃ 10000 r/min離心30 min，棄去上清液，然后5 ℃10000 r/min離心 5 min，以壓實沉淀物；棄上清，保留沉淀；加入500 μL PBS重懸沉淀，60 ℃加熱5 min充分溶解沉淀。4 ℃，10000 r/ min離心3 min，取上清液，得到病毒粗提產(chǎn)物，-20 ℃保留用于提取RNA。以提取的RNA為模板進行RT-ddPCR反應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 退火溫度的優(yōu)化結(jié)果

RT-ddPCR的退火溫度是最重要的參數(shù)，對于反應(yīng)的特異性有重要影響，退火溫度太低可能引起非特異性擴增，退火溫度過高會降低反應(yīng)的靈敏度[10]。設(shè)置GⅡ型諾如病毒的RT-ddPCR反應(yīng)程序的退火溫度為55.0 ℃，梯度差異為9.3 ℃。反應(yīng)結(jié)束后，將96孔板轉(zhuǎn)移到QX200 Droplet Reader進行讀數(shù)，各退火溫度下（55.0～64.3 ℃）實測拷貝數(shù)濃度分別為910、925、890、914、855、629、323 copies/μL，見圖1。由圖1可知，55.0～56.9 ℃時擴增結(jié)果良好，陽性微滴和陰性微滴明顯分成兩簇而且中間彌散的微滴數(shù)目很少.

圖1 不同退火溫度的RT-ddPCR法檢測GⅡ型諾如病毒的一維散點圖Fig.1 One-dimensional scatter plots of detection of GⅡ n orovir us by RT-ddPCR with different annealing temperature

圖2 退火溫度為55.7 ℃的RT-ddPCR法檢測GⅡ型諾如病毒的直方圖Fig.2 Histograms of detection of G Ⅱnorovirus by RT-ddPCR with 55.7 ℃ of annealing temperature

由圖2可知，退火溫度為55.7 ℃時，陽性峰和陰性峰顯著分開，中間沒有任何干擾，微滴數(shù)量和質(zhì)量都較好，表明此退火溫度能夠保證RT-ddPCR法定量檢測GⅡ型諾如病毒的結(jié)果的可靠性。所以為了保持與 RT-qPCR反應(yīng)的一致性，確定 GⅡ型諾如病毒的RT-ddPCR反應(yīng)的較適退火溫度為56 ℃。

2.2 RT-ddPCR和RT-qPCR的靈敏度

圖3 RT-qPCR法檢測不同稀釋度GⅡ型諾如病毒RNA的擴增曲線Fig.3 Amplication plot of detection of G Ⅱ type norovirus RNA by RT-qPCR with different dilution

以稀釋度為10-1～10-5的RNA為模板，分別進行RT-qPCR反應(yīng)和RT-ddPCR反應(yīng)。由圖3可知，稀釋度為10-1～10-4的RNA都有“S”型擴增曲線，而對于稀釋度為10-5的RNA，RT-qPCR結(jié)果和陰性對照幾乎均無擴增，由此可知RT-qPCR法檢測GⅡ型諾如病毒的靈敏度為稀釋度為10-4的RNA濃度，其Ct值（循環(huán)閾值）為32.63。

圖4 RT-ddPCR法檢測不同稀釋度GⅡ型諾如病毒RNA的一維散點圖Fig.4 One-dimensional scatter plots of detection of GⅡ norovirus RNA by RT-ddPCR with different dilution

由圖4可知，所有稀釋度均有陽性和陰性微滴，滿足泊松分布，不存在所有微滴均被RNA飽和，無陰性微滴存在的情況，所以數(shù)據(jù)有效；單個樣品內(nèi)總微滴數(shù)是檢驗實驗好壞的指標(biāo)，可接受的平均微滴數(shù)目為10000[10]，由圖5可知，所有反應(yīng)生成的可接受的平均微滴數(shù)目為13283.07，均大于10000，表明所有反應(yīng)微滴生成正常，保證了后續(xù)實驗結(jié)果分析的準(zhǔn)確性，且可看出，隨著RNA稀釋度的增高，陽性微滴逐步減少，陰性微滴逐步增加；NTC沒有檢測到陽性微滴，可見該體系沒有污染或非特異性擴增，方法的特異性良好；當(dāng)原始模板稀釋度為10-5時，實測拷貝數(shù)濃度為0.54 copies/μL，對應(yīng)原始模板的拷貝數(shù)濃度為5.40 copies/μL。對比RT-qPCR對應(yīng)濃度的結(jié)果，RT-ddPCR法檢測 GⅡ型諾如病毒的靈敏度比RT-qPCR法高一個稀釋度，檢測低限為 5.40 copies/μL。

圖5 RT-ddPCR法檢測不同稀釋度GⅡ型諾如病毒RNA的微滴數(shù)目柱狀圖Fig.5 Number of droplet events of detection of GⅡ norovirus RNA by RT-ddPCR with different dilution

2.3 RT-ddPCR和RT-qPCR的重復(fù)性

通過對五個梯度濃度的 3次重復(fù)性實驗結(jié)果分析，初步得到RT-qPCR法和RT-ddPCR法檢測GⅡ型諾如病毒的重復(fù)性，如表2所示。

由表2可知，RT-qPCR法的RSD為0.58～2.08%；RT-ddPCR法的RSD為3.74～25.00%。兩種方法的RSD均先隨RNA稀釋度的升高而減小，即精密度（精密度越高，重復(fù)性越好）升高，后隨稀釋度的升高而增大，即精密度減小，說明兩種方法在中間濃度時重復(fù)性較好。

在稀釋度為 10-3時，RT-ddPCR法的 RSD為3.74%，精密度最好，在稀釋度為10-5即RNA濃度最低時，RT-ddPCR法的RSD為25.00%精密度最差。說明在RNA濃度很低時，RT-ddPCR法的穩(wěn)定性反而不如RT-qPCR，這種情況也在其它的研究文獻中有所提及[11]，初步分析原因可能是與泊松分布統(tǒng)計算法和極低濃度核酸較分散造成吸液時各平行樣中核酸量不同有關(guān)。

表2 RT-qPCR法與RT-ddPCR法檢測的重現(xiàn)性Table 2 Repeatability of RT-qPCR and RT-ddPCR

表3 RT-ddPCR法檢測人工污染樣品的結(jié)果Table 3 Results of detection of artificially contaminated sample by RT-ddPCR

2.4 人工污染樣品檢測結(jié)果

圖6 RT-ddPCR法檢測人工污染樣品的一維散點圖Fig.6 One-dimensional scatter plots of detection of artificially contaminated sample byRT-ddPCR

各稀釋度的GⅡ型諾如病毒制得的人工污染樣品經(jīng)RT-ddPCR法檢測的結(jié)果如表3所示。由表3可知，RT-ddPCR法最低可以將人工污染西生菜中稀釋度為10-4的GⅡ型諾如病毒（RT-ddPCR檢測結(jié)果為54.00 copies/μL）檢測出來，說明RT-ddPCR法在人工污染樣品檢測中表現(xiàn)理想；且可看出，人工污染樣品的檢測低限比直接檢測的檢測低限高，這是由于人工污染樣品中病毒經(jīng)富集回收有一定損失造成的[12]。

3 結(jié)論

3.1 微滴數(shù)字RT-PCR(RT-ddPCR)是通過將微量樣品作大倍數(shù)稀釋和分液(partitioning)，通過極度稀釋實現(xiàn)理論上的單分子擴增，然后用終點法PCR和統(tǒng)計學(xué)中的泊松分布原理計算出樣品的原始濃度[13]。RT-ddPCR方法與RT-qPCR方法相比，不依賴擴增曲線的Ct值進行定量，不受擴增效率影響，也不必采用內(nèi)參基因和標(biāo)準(zhǔn)曲線，具有較好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性[14]，同時其相對 RT-qPCR具有更高的靈敏度，下限可調(diào)至單拷貝，陽性微滴計算準(zhǔn)確且直接[15]，得以實現(xiàn)絕對定量分析[15～18]。

3.2 目前數(shù)字PCR主要應(yīng)用于3方面：（1）復(fù)雜的異質(zhì)樣品中的稀有序列檢測、從外周血中獲得分子生物標(biāo)記物、血液中拷貝數(shù)很低的 HBV(hepatitis B virus，HBV)檢測[19]；（2）低頻特異突變篩查、腫瘤分子標(biāo)志物稀有突變檢測、疾病相關(guān)的基因拷貝數(shù)變異檢測；（3）病毒核酸定量檢測（如：豬圓環(huán)病毒 2型[20]、甲型流感病毒[10]）、病毒的分析、其他病原微生物的RNA檢測和基因表達分析。目前國內(nèi)已出現(xiàn)數(shù)字 PCR用于金黃色葡萄球菌[21]、沙門氏菌[22]和大腸桿菌[23]等菌的檢測的報道，國外David Polo，Julien Schaeffer[24]、Audrey Fraisse[25]和 Coralie Coudray-Meunier[26]等使用微流體數(shù)字RT-PCR（RT-dPCR）檢測諾如病毒。

3.3 本研究使用 RT-ddPCR檢測諾如病毒，優(yōu)化了RT-ddPCR反應(yīng)的退火溫度，退火溫度為55.7 ℃時，陽性峰和陰性峰顯著分開，中間沒有任何干擾，微滴數(shù)量和質(zhì)量都較好；考察了RT-qPCR和RT-ddPCR兩種方法的靈敏度及重復(fù)性，RT-ddPCR方法檢測 GⅡ型諾如病毒的靈敏度為5.40 copies/μL，其靈敏度高于RT-qPCR，重復(fù)性實驗對比表明兩種方法在在檢測中間濃度的GⅡ型諾如病毒中間濃度時重復(fù)性均較好；人工污染西生菜實驗中表明微滴式數(shù)字RT-PCR法最低檢測限為54.00 copies/μL。本研究建立了一種高靈敏度的快速準(zhǔn)確的檢測方法，方法操作簡單、使用方便、讀數(shù)直接，進一步提高了GⅡ型諾如病毒的檢測水平。

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