李明璽，王敏，甘玉迪，劉洋，黃瑩捷，萬春鵬

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)與茶文化研究中心，江西南昌 330045）（2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇南京 210095）

白茶，一種是按照制作工藝命名的白茶，通過不揉不炒，自然萎凋的獨特加工工藝制成的六大基本茶類之一輕萎凋茶類[1]。另一種是按照茶樹品種如安吉白茶、溧陽白茶、福鼎大白茶與政和大白茶等命名的品種名。白茶除了飲用外，還可以作為藥用使用，其性清涼，能退熱、降火，可治麻疹[2]，現(xiàn)代研究表明白茶具有很好的抗氧化、抗腫瘤、降血糖、減肥降脂和保肝護肝等作用[3]。白茶富含茶多酚和茶氨酸等活性成分，茶葉多酚的主要成分有兒茶素（黃烷醇）類、酚酸類、黃酮醇類和花青素等。其中黃酮醇類是一種低分子量的茶多酚類物質(zhì)，主要以黃酮糖苷的形式存在，少部分以苷元形式存在，占干物質(zhì)含量 2~4%，目前已知的植物黃酮類物質(zhì)巳有8000多種[4]。茶葉中黃酮醇類化合物的含量與茶樹品種、生長季節(jié)、加工方式和貯藏環(huán)境等密切相關(guān)，黃酮醇苷類化合物是茶湯中主要的澀味物質(zhì)，也是構(gòu)成湯色色澤的重要因子，對人體具有預(yù)防心血管疾病、抗氧化、保護肝臟及防癌等作用，是目前備受關(guān)注的茶葉天然產(chǎn)物之一[5~10]。茶氨酸，茶樹中一種比較特殊的氨基酸，茶氨酸一般占茶葉干物質(zhì)總重的 1~2%，不參與蛋白質(zhì)的合成，以游離形式存在，占茶葉中游離氨基酸總量的50%左右[11]。自然界存在的茶氨酸為L型，系統(tǒng)命名為：N-乙基-γ-谷氨酰胺，極易溶于水。茶氨酸是茶葉鮮爽味的主要成分，并且可緩解咖啡因的苦味和茶多酚的苦澀味，對人體具有神經(jīng)保護[12]、抗肥胖[13]、降血壓[14]、促進認知能力[15]、抗腫瘤、改善記憶和抗疲勞等功效[16]。

隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，由于該技術(shù)能快速地全面獲取研究對象在某一狀態(tài)下基因轉(zhuǎn)錄信息，因此該技術(shù)廣泛的應(yīng)用生物體轉(zhuǎn)錄組基因表達分析，能夠準確發(fā)掘重要功能基因[17,18]。近年來人們因白茶具有一定的藥用作用以及潛在的一些保健功能，對白茶的關(guān)注度逐漸增加。先前已有相關(guān)的報道對白茶的品種、制作工藝、品質(zhì)、化學(xué)成分和藥理活性等進行研究[19,20]，但是對于白茶的芽葉中相關(guān)基因如何調(diào)控茶多酚和茶氨酸等內(nèi)含成分代謝尚未見報道。因此本研究通過高通量測序技術(shù)，對白茶芽葉相關(guān)代謝途徑進行研究，探索白茶芽葉中類黃酮及谷胱甘肽代謝的相關(guān)基因調(diào)控對應(yīng)的代謝途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物于2017年5月10日采集于江西省宜春市靖安縣羅灣鄉(xiāng)白云白茶有限公司茶園，樣品采集當天及前五天均為晴天。茶樹品種：Camellia sinensiscultivar Jing'anbaicha，8年樹齡，海拔780米紅壤山地丘陵，屬于北亞熱帶濕潤氣候，春季回暖遲，有春寒，夏季炎熱時間長，秋季涼得快，冬季較寒冷，四季分明。氣候溫和，平均氣溫在15.0度左右，要比平原低3度以上，該地白茶發(fā)芽平均比平地晚10 d左右。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取、文庫構(gòu)建與檢測

分別從3份白茶芽、葉樣品中采用TRIzol法提取總RNA[21]，并對RNA濃度、純度、完整性進行檢測以確保數(shù)據(jù)的準確性。樣品檢測合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA。隨后加入。隨后加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以打斷后的mRNA為模板合成一鏈cDNA，然后合成二鏈cDNA。隨之利用 AMPure XP beads將合成的二鏈cDNA純化，進行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，再用AMPure XP beads進行片段大小選擇。最后進行PCR擴增，純化PCR產(chǎn)物，得到最終文庫。文庫構(gòu)建完成后，先使用Qubit 2.0進行初步定量，隨后使用Agilent 2100對文庫的插入片段大小進行檢測，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量，質(zhì)檢合格后使用Illumina 4000高通量測序平臺(HiSeq/MiSeq)進行測序。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果組裝、拼接

由Illumina 4000高通量測序平臺測序所得的數(shù)據(jù)稱為raw reads或raw data。由于原始數(shù)據(jù)存在低質(zhì)量、可能的接頭等序列，為了確保分析結(jié)果的可靠準確，需要先將這部分序列去除才能用于下一步的分析，使用FastQC[22]對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，以確定測序數(shù)據(jù)是否適用于后續(xù)分析。隨后進行Trinity[23]進行轉(zhuǎn)錄本的拼接，得到的轉(zhuǎn)錄本序列。利用 CD-HIT[24]將所有拼接出來的轉(zhuǎn)錄本進行啟發(fā)式聚類，選擇每一類中最長的轉(zhuǎn)錄本后去除其余冗余序列，從而構(gòu)建非冗余的轉(zhuǎn)錄本集合，此集合即為表達基因集合。最后從CD-HIT處理后序列挑選出最長的轉(zhuǎn)錄本作為unigene。

1.2.3 基因功能注釋

對獲得的轉(zhuǎn)錄組序列同常用的幾種數(shù)據(jù)庫進行比對注釋，其中主要的數(shù)據(jù)庫包括：Nr（NCBI蛋白質(zhì)非冗余數(shù)據(jù)庫），Pfam（蛋白家族數(shù)據(jù)庫），KOG（真核生物直系同源基因數(shù)據(jù)庫），Swiss-Prot（經(jīng)實驗驗證的蛋白序列數(shù)據(jù)庫），KEGG（基因產(chǎn)物、細胞中代謝途徑以及基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫），GO（基因本體數(shù)據(jù)庫）。

1.2.4 基因表達水平分析

RSEM[25]對bowtie2[26]的比對結(jié)果進行統(tǒng)計，進一步得到了每個樣品比對到每個基因上的 reads數(shù)目，并將其轉(zhuǎn)換成FPKM[27]值，進而分析基因的表達水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果與Trinity拼接

白茶芽轉(zhuǎn)錄組共得到 56882837 raw reads，56456634 clean reads，Q20值為 94.56%，Q30值為87.32%，序列堿基GC含量為44.84%；葉轉(zhuǎn)錄組共得到 58092923 raw reads，57800442 clean reads，Q20 值為94.51%，Q30值為87.32%，序列堿基GC含量為44.54%；表明白茶轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量較高，為隨后的數(shù)據(jù)組裝拼接，分析研究提供了較好的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。經(jīng)過Trinity轉(zhuǎn)錄本拼接和CD-HIT去冗余序列處理結(jié)果見表1。

圖1 拼接后unigene長度分布頻數(shù)圖Fig.1 Length distribution of all unigene after splicing

對拼接得到的轉(zhuǎn)錄本序列和 unigene序列長度分布統(tǒng)計可知長度<300的最多，頻數(shù)31294（如圖1所示）。以上數(shù)據(jù)表明轉(zhuǎn)錄本拼接較好，利于之后的分析研究。

表1 不同處理后序列數(shù)量、N50長度和總堿基數(shù)統(tǒng)計表Table 1 Sequence number, length of N50 and total bases treated by different data processing

2.2 基因功能注釋結(jié)果

對獲得的轉(zhuǎn)錄組序列進行數(shù)據(jù)庫比對注釋可知，共注釋了unigene數(shù)量為100568，Nr（NCBI蛋白質(zhì)非冗余數(shù)據(jù)庫）注釋的unigene數(shù)量為32530，占比最多為32.35%，KOG（真核生物直系同源基因數(shù)據(jù)庫）注釋的unigene數(shù)量為30087，占比29.82%，GO（基因本體數(shù)據(jù)庫）注釋的 unigene數(shù)量為 29010，占比28.84%，Swiss-Prot（經(jīng)實驗驗證的蛋白序列數(shù)據(jù)庫）注釋的unigene數(shù)量為24553，占比24.41%，Pfam（蛋白家族數(shù)據(jù)庫）注釋的 unigene數(shù)量為 18576，占比18.47%（如表2所示）。

表2 Unigenes注釋結(jié)果統(tǒng)計Table 2 Annotation statistics for all unigenes

2.2.1 Nr注釋結(jié)果

圖2 注釋到NR數(shù)據(jù)庫中主要物種分布圖Fig.2 Distribution of the main species annotated to NR database

通過與 Nr庫進行比對注釋，可以獲取本物種基因序列與近緣物種基因序列的相似性以及本物種基因的功能信息。將白茶的芽和葉與其他物種進行相似性比較，其中相似性排前十的有葡萄，相似度為27.95%；咖啡，相似度為5.77%；蓮，相似度為4.8%；芝麻，相似度為4.54%；麻風(fēng)樹，相似度為3.59%；美花煙草，相似度為3.1%；甜橙，相似度為2.63%；梅，相似度為2.61%；煙草，相似度為2.52%；毛果楊，相似度為2.44%（如圖2所示）。

2.2.2 GO分類

圖3 GO分類圖Fig.3 GO functional annotation distribution

對 unigene進行 GO注釋之后，將注釋成功的unigene按照GO三個大類的下一層級進行分類（如圖3所示），包括生物學(xué)過程（Biological process，BP）、細胞組分（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）。

按注釋成功unigene多少統(tǒng)計，生物學(xué)過程中較多unigene注釋的過程有代謝過程7237個、氧化還原過程3279個、生物過程3203個、磷酸化作用3095個；分子功能中較多unigene注釋的分子功能有轉(zhuǎn)移酶活性5227個、三磷酸腺苷結(jié)合體5186個、核苷酸結(jié)合域4933個、水解酶活性4276個、金屬離子結(jié)合功能的4287個；細胞組分較多unigene注釋的細胞組分有膜物質(zhì)5108個、膜的有機組成部分4322個、細胞核3676個。

2.2.3 KOG分類

圖4 KOG分類圖Fig.4 KOG functional annotation distribution

2.2.4 KEGG分類

KOG (eukaryotic ortholog groups)注釋是將真核生物的基因產(chǎn)物進行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫。將所有的unigene進行KOG注釋分類，結(jié)果有6235條unigene被注釋到25個功能類別中。其中一般功能預(yù)測注釋到的unigene最多，有1640條；其次是，信號傳導(dǎo)機制功能，被注釋到的unigene共有1367條、未知功能注釋到1289條；轉(zhuǎn)錄功能注釋到unigene 571條，細胞壁/膜/包膜生物合成注釋到 280條；防御機制注釋到202條；碳水化合物轉(zhuǎn)運代謝注釋到187條（如圖4所示）。

KEGG數(shù)據(jù)庫涉及系統(tǒng)信息、基因組信息和化學(xué)信息，是系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物在細胞中的代謝途徑以及基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫。利用KEGG數(shù)據(jù)庫可以進一步研究基因在生物學(xué)上的復(fù)雜行為，有助于進一步研究特定基因的生物功能。將白茶芽葉轉(zhuǎn)錄組 unigene序列與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對，共獲得21001個注釋結(jié)果，涉及的代謝通路可分為5大類（如圖5所示）：有機系統(tǒng)：4734條，22.54%，代謝7970條，37.95%，細胞過程2213條，10.54%，遺傳信息處理3089條，14.71%，環(huán)境信息處理2995條，14.26%。其中環(huán)境信息處理中信號傳導(dǎo)注釋的unigene數(shù)最多，為2877條，其次，代謝過程中碳水化合物代謝注釋的unigene為1643個，脂質(zhì)代謝860個，能量代謝822個，氨基酸代謝1015個，輔助因子和維生素代謝346個，其他氨基酸代謝345個，萜類化合物和聚酮化合物代謝280個，糖鏈生物合成和代謝265個，其他次生代謝物生物合成574個，異生素生物降解和代謝364個，核苷酸代謝400個。

圖5 KEGG代謝通路Fig.5 KEGG metabolic pathway

2.3 基因表達水平分析

2.3.1 基因表達水平統(tǒng)計

圖6 白茶芽葉樣品間相關(guān)性系數(shù)熱圖Fig.6 Correlation coefficient between buds and leaves of white tea

RSEM對bowtie2的比對結(jié)果進行統(tǒng)計，進一步得到了每個樣品比對到每個基因上的 reads數(shù)目，并將其轉(zhuǎn)換成FPKM值，進而分析基因的表達水平。對樣品間基因表達水平相關(guān)性進行統(tǒng)計分析（如圖6所示），芽的3個樣本重復(fù)系數(shù)接近1，表明芽樣本之間表達模式的相似度較高；葉的3個樣本重復(fù)系數(shù)也接近 1，表明葉樣本之間的表達模式的相似度也較高。而樣本芽和葉之間的重復(fù)系數(shù)比較低，表明樣品芽和葉之間的表達模式的相似度不高。因此，樣本的選取是有意義的。

2.3.2 基因表達差異分析

對于有生物學(xué)重復(fù)的樣品，采用edgeR[28]進行分析，上下調(diào)（芽vs葉）是從所有差異基因中過濾得到的過濾的值為fc為1.5，fdr 0.05（即只挑選變化倍數(shù)大于1.5，q值校正后小于0.05的基因），進行差異基因在不同樣品間的聚類分析。據(jù)統(tǒng)計結(jié)果可知大部分上調(diào)基因位于芽中，而在芽中上調(diào)的基因在葉中是下調(diào)的（如圖7所示）。

圖7 unigene在不同樣本間層次聚類熱圖Fig.7 Hierarchical clustering of unigene between buds and leaves of white tea

其中行表示的是每個 unigene表達的相對表達水平，列表示每個樣本。其中表達值(FPKM)是經(jīng)過Log2轉(zhuǎn)化。

2.3.3 差異基因GO富集分析

將所有差異表達基因映射到Gene Ontology數(shù)據(jù)庫的各個功能分類中，計算每個分類的基因數(shù)目，找出與整體基因組背景相比，在差異表達基因中顯著富集的功能分類。

其中將上調(diào)基因進行富集分析（如圖8所示），在細胞成分中，上調(diào)基因富集效果較明顯的功能有，蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，GeneRatio占比 3.31%；微管，GeneRatio占比5.62%；DNA包裝復(fù)合體，GeneRatio占比2.91%。分子功能中上調(diào)基因富集效果較明顯的功能有核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性，GeneRatio占比9.93%；轉(zhuǎn)錄因子活性，GeneRatio占比9.93%；序列特異性DNA結(jié)合，GeneRatio占比2.46%；微管運動活動，GeneRatio占比2.96%。生物過程中上調(diào)基因富集效果較明顯的功能有細胞增殖，GeneRatio占比4.86%；細胞周期過程，GeneRatio占比9.14%；有絲分裂細胞周期過程，GeneRatio占比6.65%；因此結(jié)果表明差異基因在細胞成分、分子功能、生物過程三方面主要調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成代謝。

而下調(diào)基因富集分析（如圖9所示），細胞成分功能中富集較為明顯的是類囊體，GeneRatio占比11.07%；光合膜，GeneRatio占比9%；葉綠體類囊體，GeneRatio占比9.17%；分子成分功能中富集較為明顯的是氧化還原酶活性，GeneRatio占比22.31%；碳水化合物結(jié)合，GeneRatio占比5.32%；單加氧酶活性，GeneRatio占比3.47%。生物過程功能中富集較為明顯的是光合作用，GeneRatio占比6.34%；光合作用，光反應(yīng)，GeneRatio占比4.55%；氧化還原過程，GeneRatio占比22.2%。因此，下調(diào)基因在細胞成分、分子功能、生物過程三方面主要調(diào)節(jié)光合作用。

圖8 上調(diào)差異基因（芽vs葉）的GO富集結(jié)果Fig.8 GO enrichment of up-regulation differential genes between buds and leaves

圖9 下調(diào)差異基因（芽vs葉）的GO富集結(jié)果Fig.9 GO enrichment of down-regulation differential genes between buds and leaves

2.3.4 差異基因KEGG富集分析

Pathway顯著性富集分析以KEGG Pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗，找出差異基因相對于所有注釋的基因顯著富集的 Pathway。上調(diào)差異基因顯著富集的通路有DNA復(fù)制、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、黃酮類化合物的生物合成、淀粉與蔗糖代謝、芪類化合物，二芳基庚酸類，姜辣素的生物合成、苯丙素的生物合成、嘧啶代謝、半乳糖代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、類胡蘿卜素的生物合成等(如圖10所示)。

圖10 上調(diào)基因（芽vs葉）參與的KEGG代謝通路富集結(jié)果Fig.10 Enrichment of up-regulation gene assignments to KEGG metabolic pathway

圖11 上調(diào)基因參與的茶多酚生物合成通路Fig.11 Up-regulation gene assignments to tea polyphenol biosynthesis metabolic pathway

圖12 下調(diào)基因（芽vs葉）參與的KEGG代謝通路富集結(jié)果Fig.12 Enrichment of down-regulation gene assignments to KEGG metabolic pathway

上調(diào)差異基因c18160_g1(Flavanone 4-reductase，EC:1.1.1.219 和 1.1.1.234)；c5373_g1、c8716_g1、c4214_g1和c11557_g1(Leucoanthocyanidin reductase，EC:1.17.1.3)；c19353_g1；c58885_g1；c34005_g1；c20606_g1、c11632_g1；c19095_g3；c2214_g1；c20311_g4；c15445_g2、c15445_g3（Shikimate O-hydroxycinnamoyl transferase，EC:2.3.1.133）；c18003_g1（Leucoanthocy-anidin dioxygenase，EC:1.14.11.19）主要調(diào)節(jié)黃酮類化合物的生物合成，黃酮類化合物的生物合成與茶葉中的茶多酚形成密切相關(guān)，最終合成兒茶素、表兒茶素和沒食子兒茶素等茶多酚（圖11）。上調(diào)差異基c18645_g2；c18645_g1；c24761_g1；c9116_g1；c52277_g1；c37605_g1；c5153_g1；c47045_g1；c11055_g1；c20096_g7；c18271_g1；c13851_g1；c18630_g6調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝，谷胱甘肽是一種含Y-酰胺鍵和巰基的三肽且其中包含谷氨酸，與茶葉中的茶氨酸合成相關(guān)。

下調(diào)差異基因顯著富集的通路有光合作用、乙醛酸鹽代謝、光合生物固碳、苯丙素的生物合成、單萜類生物合成、碳代謝、半乳糖代謝、戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換、類胡蘿卜素的生物合成、自噬調(diào)節(jié)、其他類型的O-聚糖的生物合成、氮代謝和甘油酯代謝等（如圖12所示）。

下調(diào)差異基因c10462_g3；c15881_g1；c15881_g2；c8421_g1；c19569_g1調(diào)節(jié)類胡蘿卜素的生物合成，類胡蘿卜素的生物合成與茶樹萜類和聚酮化合物形成有關(guān)，因此有利于葉綠素的形成，從而促進光合作用有關(guān)。

3 結(jié)論

3.1 Illumina 4000高通量測序平臺（HiSeq/MiSeq）進行測序，為基因組大片斷候選基因序列的產(chǎn)出提供了高質(zhì)量、高通量、低成本的基礎(chǔ)，能夠確保了測序的真實性和序列的高度精確性以及數(shù)據(jù)的豐富性，很好的解決了同聚物和重復(fù)序列等問題，因此受到了國內(nèi)外越來越多研究者的青睞。因此本研究通過該方法從分子方面研究白茶芽和葉的代謝途徑差異，能夠深層地探究茶葉獨特的內(nèi)含物質(zhì)形成機理。

3.2 茶樹富含茶多酚類和多糖類物質(zhì)，容易與核酸形成不可逆結(jié)合，從而導(dǎo)致RNA降解，因此在研究過程中能夠采取適當?shù)姆椒ㄌ崛NA為能夠達到建庫、組裝要求的重要前提。本研究的樣品在取材后迅速置于液氮中速凍，然后移至-80 ℃冰箱保存，RNA提取時，樣品在液氮條件下充分研磨，在液氮剛剛揮發(fā)完時，將樣品迅速轉(zhuǎn)移至含裂解液的容器中，立即混勻勻漿，最后用TRIzol法提取，使得RNA降解較少，為實驗順利進行提供了可靠地基礎(chǔ)。測序結(jié)果得到Q30>86，100568條序列，N50(bp)為1904等測序結(jié)果表明測序質(zhì)量相對較好，能夠滿足轉(zhuǎn)錄分析要求。利用NCBI中數(shù)據(jù)庫共注釋了unigene數(shù)量為100568，NR（NCBI蛋白質(zhì)非冗余數(shù)據(jù)庫）unigene數(shù)量為32530，占比最多為32.35%，KOG（真核生物直系同源基因數(shù)據(jù)庫）unigene數(shù)量為30087，占比29.82%，GO（基因本體數(shù)據(jù)庫）unigene數(shù)量為 29010，占比28.84%，Swiss-Prot（經(jīng)實驗驗證的蛋白序列數(shù)據(jù)庫）unigene數(shù)量為24553，占比24.41%，Pfam（蛋白家族數(shù)據(jù)庫）unigene數(shù)量為18576，占比18.47%，因此可以看出還有很多基因并沒有被注釋到相對應(yīng)的功能中，這種現(xiàn)象在大部分轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中都有出現(xiàn)，這可能與 unigene片段太短有關(guān)，數(shù)據(jù)庫基因注釋信息缺乏、白茶芽葉中新基因的存在等因素都有關(guān)系。

3.3 從樣品間基因表達水平相關(guān)性統(tǒng)計分析結(jié)果看出，同一組織相關(guān)系數(shù)比較高，不同組織相關(guān)性系數(shù)不高說明樣品選取是有意義的，為之后的基因功能和通路分析提供了保障。通過KEGG通路分析結(jié)果可以看出共有16條上調(diào)基因調(diào)節(jié)與類黃酮合成途徑有關(guān)，13條上調(diào)基因調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝有關(guān)，5條下調(diào)基因調(diào)節(jié)光合代謝有關(guān)。相同的加工工藝條件下，不同季節(jié)茶樹鮮葉茶葉品質(zhì)上有很大的差別，主要是因為內(nèi)含成分的差別，因此在不同季節(jié)會對應(yīng)的差異基因有所影響。除此之外，環(huán)境因素，病蟲害等因素都會影響差異基因變化。所以，在之后的研究中將會進一步對茶樹相關(guān)的代謝產(chǎn)物進行深入的探究。

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