易鴛鴦，趙亞南，馬鵬睿，李斌，蘇艷

新疆農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，新疆 烏魯木齊 830052

金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aur eus) 是一種重要的人獸共患化膿性感染病原菌[1]，近年來發(fā)現(xiàn)由該菌所致的感染呈逐年增加的趨勢，單純依靠抗生素治療由其引發(fā)的感染變得越來越困難。目前以S. aureus活的或滅活的菌體、細胞壁錨定蛋白、莢膜多糖、外毒素等為靶抗原的疫苗雖可顯示出一定的保護作用，但臨床效果并不理想[2-3]。

對于新的更有效抗原靶標的發(fā)掘和免疫反應(yīng)類型的研究，必將為有效的S. aureus疫苗的開發(fā)帶來希望。S. aur eus的 ESAT-6 (Early secreted antigenic target-6 kDa) 分泌系統(tǒng)由 11種蛋白組成，可引發(fā)宿主嚴重炎癥和細胞凋亡[4-5]。EsxA蛋白是該系統(tǒng)中一個主要的分泌蛋白，是S. aureus的早期靶向蛋白，可協(xié)助S. aureus的逃逸，引起反復(fù)與持續(xù)性感染[6]。EsxA缺陷株可降低感染小鼠膿腫的形成，該結(jié)果也提示 EsxA蛋白在S. aureus致病過程中發(fā)揮著重要作用[7-8]。研究表明，EsxA蛋白可誘導宿主的T淋巴細胞增殖活化和細胞因子的產(chǎn)生[9]，Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，EsxA蛋白可誘導小鼠產(chǎn)生Th1和Th17介導的免疫反應(yīng)，提示該蛋白在S. aureus疫苗研究中具有潛在發(fā)展前景[11]。目前有關(guān)S. aureus的EsxA蛋白如何在機體與該菌的相互作用和免疫過程中發(fā)揮作用的機制尚不完全清楚。

為更深入、全面地認識和評價 EsxA蛋白在S. aureus免疫過程的作用與特點，本研究表達了牛乳源S. au reus的EsxA重組蛋白，并以該重組蛋白免疫小鼠，分析免疫后特異性IgG抗體亞型的變化規(guī)律和特征，通過攻毒后比較分析不同組織臟器的病理組織學變化、各組織荷菌數(shù)的變化及對小鼠的免疫保護效果，綜合評價了 EsxA蛋白的免疫原性。該研究結(jié)果將為新型、高效、安全的S. aureus疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及菌株

牛乳源S. aureus分離株GW20-2由新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院微生物實驗室分離鑒定并保存。原核表達載體pET-28a(＋)、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21(DE3)均由本室保存。

1.2 主要試劑

DL2000 DNA marker、DL5000 DNA marker、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；Ni-NTA Resin購自北京全式金生物技術(shù)公司；山羊抗鼠HRP-IgG、山羊抗兔HRP-IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TMB顯色液、DAB顯色液購自北京索萊寶科技有限公司。兔抗S. aureus多克隆抗體由本室用滅活S. aureus全菌免疫實驗兔制備。

1.3 實驗動物

18?20 g雌性昆明白小鼠購自新疆維吾爾自治區(qū)動物疾病控制中心。將42只小鼠隨機分為3組，每組14只：EsxA免疫組、滅活全菌免疫組和PBS對照組。

1.4 EsxA基因的擴增及重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中S. aureus的EsxA基因序列(JOVN01000006.1) 設(shè)計引物，上游引物 P1：5′-GCGGAATTC ATGGCAATGATTAAGATGAGT CC-3′ (下劃線處為EcoRⅠ酶切位點)，下游引物P2：5′-TAACTCGAGTTTGCAAACCGAAATTAT TAG-3′ (下劃線處為XhoⅠ酶切位點)。預(yù)期擴增片段為 294 bp，引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。

以S. aureus分離株基因組為模板，擴增獲得目的基因EsxA。反應(yīng)體系：Taq酶 0.25 μL、Taq緩沖液Ⅱ2.5 μL 、25 mmol/L MgCl22.5 μL、dNTPs(各 25 mmol/L) 4 μL、上下游引物各 0.5 μL、模板DNA 1 μL，加 ddH2O 至 25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸15 min。EsxA和pET-28a(＋)載體分別經(jīng)EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切，用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3) 感受態(tài)細胞，PCR鑒定后挑取陽性克隆送生工生物工程 (上海) 股份有限公司測序。

1.5 重組蛋白EsxA的誘導表達及純化

將測序正確重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21(DE3) 感受態(tài)細胞中，挑取單菌落接種于含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)，至OD600為 0.6時加入 IPTG至終濃度1 mmol/L，30 ℃誘導表達5 h，離心收集菌體，超聲破碎菌體。用 Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白質(zhì)，進行SDS-PAGE分析。

1.6 重組蛋白EsxA的Western blotting分析

將純化后的EsxA蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜，4 ℃過夜封閉，用兔抗S. aureus多克隆抗體 (1∶300稀釋) 為一抗，37 ℃孵育1 h，清洗后用HRP標記山羊抗兔IgG (1∶1 000稀釋) 為二抗，37 ℃孵育1 h，清洗后用DAB顯色液顯色。

1.7 小鼠免疫

將純化的EsxA蛋白按1∶1體積比與弗氏佐劑乳化，皮下注射免疫小鼠，共免疫 2次 (初次免疫加弗氏完全佐劑，第2次免疫加弗氏不完全佐劑)，EsxA免疫組的劑量為50 μg，滅活全菌組免疫劑量為 0.6×107CFU，PBS對照組注射量為100 μL，初次免疫后3周進行第2次免疫，第2次免疫劑量同第一次免疫劑量。初次免疫后0、14、35、42 d斷尾采血，分離血清備用。

1.8 免疫小鼠抗體水平及抗體亞型的檢測

用間接ELISA方法檢測多克隆抗體亞型。用純化后的EsxA重組蛋白包被ELISA板，100 ng/孔，4 ℃過夜。37 ℃封閉1 h，將梯度稀釋的各免疫組小鼠血清加入孔中，37 ℃作用1 h，加入1∶4 000稀釋HRP 標記的羊抗鼠 IgG、IgG2a、IgG1，100 μL/孔，37 ℃作用30 min，洗滌5次，用TMB顯色15 min，最后用1 mol/L硫酸終止反應(yīng)，測定OD450值。

1.9 小鼠攻毒試驗

首次免疫后第42天，對小鼠腹腔接種S. aureus分離株GW20-2，每只小鼠攻擊菌量為1×108CFU，攻毒后連續(xù)14 d觀察并記錄小鼠的發(fā)病和死亡情況，并計算保護率。

1.10 病理組織學觀察

攻毒后第10天，分別取各試驗組小鼠肝、脾和腎組織置于10%福爾馬林溶液中固定，制作石蠟切片，HE染色，觀察各臟器的病理組織學變化。

1.11 菌體載量檢測

攻毒后第3天，處死實驗組及空白組小鼠各3只，將死亡小鼠無菌條件下剖檢取出其肝、脾和腎并稱其重量；加入滅菌生理鹽水進行充分研磨，梯度稀釋后涂布于固體培養(yǎng)基，每個稀釋度3個重復(fù)，37 ℃倒置培養(yǎng)12 h；對培養(yǎng)結(jié)果進行細菌計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組蛋白的表達及純化

SDS-PAGE結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化后大腸桿菌BL21(DE3) 經(jīng)IPTG誘導后在16.7 kDa左右處有明顯的蛋白帶 (圖 1)，大小與預(yù)期一致，純化的結(jié)果也表明EsxA重組蛋白表達成功。

2.2 重組蛋白的Western blotting分析

將純化的EsxA重組蛋白進行 Western blotting分析，結(jié)果顯示誘導表達并純化的 EsxA重組蛋白能夠與兔抗S. aureus血清發(fā)生特異性反應(yīng) (圖2)，表明該重組蛋白有良好的抗原性。

2.3 EsxA免疫小鼠后的抗體檢測

2.3.1 IgG的檢測

用間接ELISA對小鼠第2次免疫后抗體的檢測結(jié)果表明，免疫組小鼠的 EsxA特異性抗體水平與對照組相比明顯升高 (P<0.01)，且免疫后抗體隨免疫時間增加呈上升趨勢 (圖3A)，EsxA免疫組誘導的抗體水平低于滅活全菌免疫組，顯示其具有一定的抗體誘導能力 (圖3B)。

圖1 重組蛋白EsxA的SDS-PAGE分析Fig. 1 SDS-PAGE analysis of recombinant protein EsxA. M: protein marker; 1: recombinant bacterial extract before induction; 2: recombinant bacterial extract after induction; 3: supernatant after ultrasonic disruption;4: pellets after ultrasonic disruption; 5–6: purified recombinant protein.

圖2 重組蛋白EsxA表達后的Western blotting分析Fig. 2 Western blotting analysis of the expressed recombinant protein EsxA. M: prestained protein marker;1: purified protein EsxA; 2: negative control.

2.3.2 小鼠血清抗體亞型的檢測

ELISA檢測結(jié)果表明，免疫后各免疫組小鼠血清中都產(chǎn)生了特異性抗體IgG1和IgG2a。EsxA免疫組小鼠血清中的抗體亞型以 IgG1為主，且IgG1抗體水平顯著高于滅活全菌免疫組及對照組 (圖 4，P<0.05)。

2.3.3 小鼠免疫保護力檢測

首次免疫后第 42天，以S. aur eus菌株GW20-2對小鼠攻毒并觀察14 d。結(jié)果顯示，PBS對照組全部死亡，滅活全菌免疫組的保護率為87.5%，EsxA免疫組的保護率為75% (圖5)。

圖3 免疫小鼠的血清IgG檢測Fig. 3 Serum IgG detection of immunized mice. (A)Antibody level changes of immunized mice. (B) Serum antibody titers detection of immunized mice. Different minuscule letters means significant difference P<0.05,Different capital letters means extremely significant difference, P<0.01.

圖4 免疫小鼠血清抗體亞型的檢測結(jié)果Fig. 4 Detection results of serum antibody subtype levels of immunized mice. (A) Detection of serum IgG1 of different immunization groups. (B) Detection of serum IgG2a of different immunization groups. Different minuscule letters means significant difference P<0.05, Different capital letters means extremely significant difference, P<0.01.

2.3.4 病理組織學觀察

攻毒后第 10天對小鼠不同組織進行病理組織學觀察。

脾臟：與未攻毒對照組相比，攻毒對照組小鼠脾臟內(nèi)出現(xiàn)了結(jié)締組織增生和出血現(xiàn)象，可觀察到紅細胞的群集。滅活全菌免疫組小鼠的脾臟變化不明顯，EsxA免疫組小鼠的脾臟出現(xiàn)出血(圖 6)。

圖5 免疫小鼠攻毒保護力檢測Fig. 5 Detection of survival rate of immunized mice following challenge.

圖6 各組小鼠脾臟病理組織學變化 (HE染色，400×)Fig. 6 Histological changes of spleens from mice of various groups (HE staining, 400×). (A) No challenge control group.(B) S. au reus challenge group. (C) Recombinant protein EsxA immunized group. (D) Inactivated whole bacteria immunization group.

腎臟：與未攻毒對照組相比，攻毒組小鼠出現(xiàn)了明顯的腎間質(zhì)充血、水腫，腎小管水腫。滅活全菌免疫組和 EsxA免疫組小鼠腎間質(zhì)充血、水腫現(xiàn)象有所減輕(圖7)。

肝臟：與未攻毒對照組相比，攻毒組小鼠出現(xiàn)了肝臟膽汁外泄、肝細胞顆粒變性、肝細胞溶解、壞死。滅活全菌免疫組和 EsxA免疫組小鼠肝臟膽汁外泄、肝細胞顆粒變性、肝細胞溶解、壞死有減輕，病理變化有明顯差異(圖8)。

圖7 各組小鼠腎臟病理組織學變化(HE染色，400×)Fig. 7 Histological changes of kidneys from mice of various groups (HE staining, 400×). (A) No challenge control group. (B) S. au reus challenge group. (C) Recombinant protein EsxA immunization group. (D) Inactivated whole bacteria immunization group.

圖8 各組小鼠肝臟病理組織學變化 (HE染色，400×)Fig. 8 Histological changes of livers from mice of various groups (HE staining, 400×). (A) No challenge control group.(B) S. au reus challenge group. (C) Recombinant protein EsxA immunized group. (D) Inactivated whole bacteria immunization group.

2.3.4 荷菌數(shù)檢測

對小鼠攻毒后第3天，檢測小鼠脾臟、腎臟和肝臟組織荷菌數(shù) (圖 9)。結(jié)果表明，滅活全菌免疫組和 EsxA免疫組小鼠脾臟、腎臟和肝臟組織荷菌數(shù)均顯著低于對照組，EsxA免疫組小鼠脾臟組織荷菌數(shù)明顯低于全菌免疫組，該結(jié)果與脾臟的病理組織學觀察結(jié)果一致。

3 討論

高致病性的金黃色葡萄球菌威脅人類和動物的健康，不僅可導致嚴重的感染，在世界范圍內(nèi)造成巨大的損失，且該類感染具有治愈率低、反復(fù)發(fā)生等特點[12]。在S. aureus新型疫苗研發(fā)中，抗原的選擇非常重要。S. aureus的致病性由許多不同因子決定[13]，以往對S. aureus研究的過程中已證明了該菌的多種黏附因子在該菌感染時和免疫逃避中發(fā)揮重要作用，這些黏附分子在免疫后也可誘導機體產(chǎn)生抵抗S. aureus感染的抗體[14]。以往實驗證據(jù)也表明，在對實驗動物以S. aur eu攻擊時，單一抗原往往不能提供完全的保護[15-16]。基于S. aur eu黏附因子的研究表明，應(yīng)當重視S. aureu多種抗原成分的研究應(yīng)用，同時注意其免疫反應(yīng)的類型，例如對Th17和Th1介導的免疫反應(yīng)的誘導與調(diào)節(jié)[17-18]。

EsxA是S. aureus的ESX系統(tǒng)的一個早期蛋白[19]，是該菌的重要毒力因子[20-21]，已被證明與該菌感染過程中的膿腫形成有關(guān)[22]。近期研究發(fā)現(xiàn)S. aur eus分泌的 EsxA是與結(jié)核分枝桿菌ESAT-6序列同源的一種蛋白[23]。目前結(jié)核桿菌的ESAT-6、CFP-10已被作為非常有潛力的抗結(jié)核亞單位疫苗進入臨床測試，并基于這兩種分子形成了商業(yè)化的檢測技術(shù)[24]。國內(nèi)學者將結(jié)核分枝桿菌mpt59和EsxA蛋白融合表達，并將該融合蛋白初步用于結(jié)核患者的快速診斷，證明其診斷結(jié)核的敏感性為97.8%，特異性為100%[25]。

本研究成功表達與純化了牛乳源S. aureus的EsxA蛋白，該重組蛋白可與該菌陽性血清特異性結(jié)合，免疫小鼠可有效誘導特異性抗體，抗體效價可達1∶900，表明該蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。本研究中我們將 EsxA蛋白與滅活全菌抗原分別進行免疫進行對比后發(fā)現(xiàn)，EsxA蛋白免疫可在該菌對脾臟的感染定植方面表現(xiàn)出優(yōu)于滅活全菌免疫的特點，也進一步證明了對該菌的有效免疫中多種抗原成分應(yīng)用的必要性。

圖9 各組小鼠的脾、腎和肝臟組織荷菌數(shù)檢測Fig. 9 Detection of bacterial loads from mice of various groups.

Zhang等[9]發(fā)現(xiàn)重組的EsxA和EsxB蛋白用于免疫小鼠，可顯著提高小鼠對S. aureus的免疫力，且證明了其可誘導 Th17(T-helper 17)及IL17(Interleukin 17) 介導的免疫反應(yīng)。本研究中用 EsxA免疫小鼠后分析其誘導的抗體類型，結(jié)果表明，EsxA重組蛋白和滅活全菌免疫組小鼠IgG1的抗體水平顯著高于 IgG2a的抗體水平，EsxA重組蛋白和滅活全菌免疫小鼠后主要誘導產(chǎn)生了以Th2為主的體液免疫應(yīng)答，EsxA蛋白在誘導IgG1型抗體反應(yīng)方面優(yōu)于滅活全菌菌苗。本研究的結(jié)果也表明，EsxA重組蛋白也能誘導一定水平的 IgG2a 抗體的產(chǎn)生，但與對照組差異不顯著。

Wang等[20]推測，EsxA具有開發(fā)為預(yù)防S. aureus感染疫苗的潛力，其可能成為針對該菌感染非常有效的疫苗靶標。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，用 EsxA免疫后攻毒，小鼠肝、脾和腎臟的菌體定植均低于未免疫對照組，尤其是小鼠脾臟中S. aureus的計數(shù)顯著低于滅活全菌免疫組，該結(jié)果表明EsxA是一種有潛力和有價值的免疫靶標。盡管本研究中EsxA蛋白誘導特異IgG1型抗體水平滅活全菌菌苗，但免疫后的攻毒保護力卻低于滅活全菌菌苗，我們對該研究結(jié)果分析認為，在S. aureus免疫中可能非抗體依賴的免疫保護和多種抗原成分的參與會發(fā)揮重要的保護作用，這一點與Misstear等[26]的論點是一致的。

本研究中 EsxA免疫組與滅活全菌免疫組相比，在免疫保護力上雖未顯出明顯優(yōu)勢，但具有能控制疾病的發(fā)生和嚴重程度的獨特優(yōu)勢。

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