徐嫄，鄒興啟，李翠，朱元源，何天慈，楊延麗，林旋，宋艷民，鄭金來(lái)，張松平，趙啟祖

1 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081

2 中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所 生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190

3 北京標(biāo)馳澤惠生物科技有限公司，北京 102600

口蹄疫 (Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD) 是傳染性最強(qiáng)的家畜疫病之一。目前，我國(guó)對(duì)口蹄疫采取以滅活疫苗免疫為主的防控策略，使用的滅活疫苗以雙相油乳劑疫苗為主，疫苗的質(zhì)量對(duì)于口蹄疫的防控至關(guān)重要[1-2]。疫苗對(duì)動(dòng)物的保護(hù)效果主要取決于兩個(gè)方面，一是疫苗毒株與流行毒株的相似程度，二是疫苗中抗原的含量[3]?！吨袊?guó)獸藥典》規(guī)定[2]，口蹄疫滅活疫苗質(zhì)量的最終評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)是本動(dòng)物免疫攻毒試驗(yàn)，該項(xiàng)檢驗(yàn)必須使用抗體陰性的本動(dòng)物，不僅試驗(yàn)費(fèi)用昂貴，還涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理問(wèn)題[4]。而疫苗中有效抗原，即完整的病毒粒子 (146S) 的含量測(cè)定，是大型疫苗生產(chǎn)廠家和國(guó)際口蹄疫疫苗儲(chǔ)備庫(kù)控制疫苗中間生產(chǎn)過(guò)程的重要環(huán)節(jié)。國(guó)際上通用的測(cè)定146S抗原含量的方法是利用蔗糖或氯化銫密度梯度離心法，通過(guò)測(cè)定各個(gè)級(jí)份在259 nm的OD值，最終計(jì)算出抗原的濃度。該方法操作復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，每次檢測(cè)樣品數(shù)量有限，且在操作過(guò)程中極易導(dǎo)致146S抗原的損失，結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性受較多因素影響，因此尚未標(biāo)準(zhǔn)化[5-7]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA) 因其靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在146S抗原的測(cè)定中被廣泛關(guān)注，但因該方法不具有通用性而受到局限[8-10]。因此，亟待應(yīng)用更高效、經(jīng)濟(jì)的方法測(cè)定疫苗中146S的含量。體積排阻色譜技術(shù)是根據(jù)待測(cè)組分的分子大小進(jìn)行分離的一種液相色譜技術(shù)，分離原理為凝膠色譜柱的分子篩機(jī)制。樣品進(jìn)入色譜柱后，不同組分按其分子大小進(jìn)入相應(yīng)孔內(nèi)，大分子因不能進(jìn)入顆粒內(nèi)部，在色譜柱中滯留時(shí)間短，先于小分子被流動(dòng)相洗脫至柱外，通過(guò)這種分子篩效應(yīng)，各組分從大到小依次被洗脫。體積排阻色譜技術(shù)常用于生物大分子的分離和純化。Spitteler等[6]和楊延麗等[10]均使用體積排阻色譜法對(duì)滅活的口蹄疫病毒液中的146S抗原進(jìn)行檢測(cè)，認(rèn)為該技術(shù)在疫苗生產(chǎn)工藝研究和質(zhì)量控制中均具有應(yīng)用前景。Vajda等[11]應(yīng)用該技術(shù)分離了 3株流感病毒，并通過(guò)紅細(xì)胞凝聚活性測(cè)定進(jìn)行了驗(yàn)證。本研究首次將高效液相體積排阻色譜技術(shù)應(yīng)用于口蹄疫滅活疫苗中146S抗原含量的測(cè)定，通過(guò)方法學(xué)考察，證明了該方法具有準(zhǔn)確、高效等優(yōu)勢(shì)，初步建立了一種新的口蹄疫滅活疫苗中 146S抗原含量的高效液相色譜檢測(cè)方法，為口蹄疫滅活疫苗質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了一種更加快速、高效的新技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

L-2000型高效液相色譜儀 (Hitachi公司)，L203型電子天平 (梅特勒-托利多)。

1.2 主要試劑

50 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 8.0，含0.15 mol/L NaCl) (PBS)，聚乙二醇 (PEG) 6000 (國(guó)藥集團(tuán)優(yōu)級(jí)純)，ISA206油佐劑，DMEM培養(yǎng)液，胎牛血清FBS，口蹄疫O型抗原Mya98株測(cè)試卡、口蹄疫A型抗原測(cè)試卡 (北京標(biāo)馳澤惠生物技術(shù)有限公司)。

1.3 測(cè)試樣品

口蹄疫病毒 (O型) 146S抗原純化樣品(67.42 μg/mL)，由中農(nóng)威特生物科技股份有限公司提供滅活抗原液 (O/Mya98)，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備?？谔阋卟《緶缁羁乖?(O/Mya98)、口蹄疫病毒滅活抗原液 (AF72)，分別由金宇保靈生物藥品有限公司和中農(nóng)威特生物科技股份有限公司提供。供試疫苗樣品16批，由國(guó)內(nèi)4家口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)企業(yè)提供。未接毒BHK-21細(xì)胞，由金宇保靈生物藥品有限公司提供。豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(YZ株)，豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗 (CH-1a株)，為中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所疫苗檢品留樣。

1.4 色譜條件

色譜柱：TSKgel G4000SWXL(7.8 mm×30 cm)色譜柱 (TOSOH)、TSKgel guard column SWXL(6.0 mm×4 cm) 保護(hù)柱 (TOSOH)；流動(dòng)相：pH 7.2的50 mmol/L磷酸緩沖液，含0.1 mol/L Na2SO4；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)：259 nm；流速：0.6 mL/min。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

用滅菌磷酸鹽緩沖液對(duì) 146S純化樣品進(jìn)行系列稀釋，至最低濃度為0.56 μg/mL。按上述色譜條件，進(jìn)樣100 μL檢測(cè)。以儀器積分得到峰面積為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)146S濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸。

1.6 抗原液PEG濃縮與疫苗配制

向滅活抗原液中加入40% PEG 6000磷酸鹽溶液，使PEG 6000終濃度為8%，充分混勻，置4 ℃過(guò)夜，8 000 r/min、4 ℃離心30 min，棄去液體，將沉淀重懸于適量PBS中，吹打使充分溶解，8 000 r/min、4 ℃離心10 min，保留上清液，為抗原濃縮液。用PBS對(duì)抗原濃縮液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，與 ISA206油佐劑等體積混合，劇烈振搖使之乳化，即得口蹄疫滅活疫苗。

1.7 疫苗前處理

分別使用正丁醇、正戊醇、正己醇、正庚醇、正己烷、三氯甲烷作為破乳試劑對(duì)疫苗進(jìn)行破乳。分別按疫苗體積與破乳試劑 9∶1 (體積比) 充分振搖混合，4 ℃靜置30 min分層后，3 000 r/min、4 ℃離心5 min，比較破乳分層情況。

1.8 抗原鑒別

應(yīng)用口蹄疫O型抗原Mya98株測(cè)試卡和口蹄疫A型抗原測(cè)試卡檢測(cè)3份自制疫苗，參照操作說(shuō)明，向測(cè)試卡樣品孔中緩慢滴加70 μL破乳水相，水平放置20 min后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 線性范圍

將146S純化樣品色譜檢測(cè)結(jié)果作圖 (圖1)，經(jīng)線性回歸處理，得到146S的回歸方程為：Y=45 216X–78 422 (R2=0.996，n=10)，結(jié)果表明，146S在0.56–67.42 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，當(dāng)濃度為0.56 μg/mL時(shí)，S/N=14.62，滿足定量限要求。146S抗原保留時(shí)間在13–14 min (圖2)。

2.2 口蹄疫滅活疫苗配制

抗原濃縮液經(jīng)體積排阻色譜法測(cè)定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算146S濃度，得抗原濃縮液 (O/Mya98) 為45.49 μg/mL，抗原濃縮液 (AF72) 為 44.08 μg/mL。利用以上抗原濃縮液配制3份疫苗，分別為口蹄疫O型滅活疫苗，抗原含量33.3 μg/mL，口蹄疫A型滅活疫苗，抗原含量22.7 μg/mL，口蹄疫O型、A型二價(jià)滅活疫苗，抗原總含量29.1 μg/mL。另用PBS與ISA206油佐劑等體積混合，配制空白對(duì)照樣。利用以上自制疫苗進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

圖1 口蹄疫滅活病毒 (O型) 146S抗原定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Calibration curve for qualification of inactivated FMDV 146S antigen (O/Mya98).

圖2 口蹄疫滅活病毒 (O型) 146S抗原純化樣品色譜圖Fig. 2 Chromatograms of pure inactivated FMDV 146S antigen (O/Mya98).

2.3 破乳試劑的確定

比較了6種試劑對(duì)疫苗的破乳效果，結(jié)果顯示，使用正己烷、三氯甲烷，4 ℃靜置30 min后不能有效分離油相和水相，其余4種破乳試劑靜置離心后，以正丁醇、正戊醇破乳水相體積高且澄清，正己醇、正庚醇破乳得到水相體積偏低 (圖3)。色譜檢測(cè)正丁醇、正戊醇破乳后水相中的 146S抗原，結(jié)果基本一致。本實(shí)驗(yàn)選用正戊醇作為破乳試劑。

2.4 重復(fù)性和精密度

取口蹄疫A型滅活疫苗破乳水相，連續(xù)進(jìn)樣6次，將數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，結(jié)果重復(fù)性良好 (RSD=0.5%，n=6) (表1)。取3份實(shí)驗(yàn)室配制的疫苗分別破乳測(cè)定3次，每次平行進(jìn)樣2針，每次測(cè)定間隔1周，將數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量和回收率。結(jié)果表明，3份疫苗的回收率分別為93.6% (RSD=2.7%，n=3)、102.3% (RSD=2.6%，n=3)、95.5% (RSD=5.1%，n=3) (表 2)，該方法的重復(fù)性、精密度均良好，色譜結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.5 特異性

對(duì)空白對(duì)照苗、24 h培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞、豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗 (YZ株) 和豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗 (CH-1a株) 進(jìn)行色譜檢測(cè)，結(jié)果顯示，在146S保留時(shí)間13–14 min均未見(jiàn)吸收峰 (圖5)，因此不會(huì)對(duì)146S峰面積造成干擾，方法的特異性良好。

圖3 不同試劑對(duì)疫苗的破乳結(jié)果Fig. 3 Results of demulsification of vaccines by different reagents. (A) n-butyl alcohol. (B) n-pentanol. (C) n-hexyl alcohol. (D) n-heptanol. (E) n-hexane. (F) Chloroform.

表1 重復(fù)性測(cè)量結(jié)果Table 1 Results of reproducibility measurement

表2 精密度測(cè)量結(jié)果Table 2 Results of accuracy measurement

圖4 實(shí)驗(yàn)室自制疫苗色譜圖Fig. 4 Chromatograms of vaccines formulated in our lab. (A) Vaccine (Type O). (B) Vaccine (Type A). (C) Vaccine (Type O, Type A).

圖5 對(duì)照色譜圖Fig. 5 Chromatograms of control samples.

2.6 耐受性試驗(yàn)

通過(guò)改變流動(dòng)相 pH值和環(huán)境溫度，考察方法耐受性。TSKgel G4000SWXL色譜柱pH適用范圍在2.5–7.5，且應(yīng)置于4–30 ℃。維持146S抗原穩(wěn)定性的最適pH值為7.8。調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值范圍在6.9–7.5，146S抗原色譜峰保留時(shí)間和峰形一致，考慮到色譜柱耐受性，選用該流動(dòng)相未經(jīng)調(diào)節(jié)的pH值7.2–7.4。為防止146S降解，需注意實(shí)驗(yàn)室溫度不應(yīng)過(guò)高，且儀器樣品盤應(yīng)設(shè)定低溫進(jìn)樣。

2.7 抗原鑒別

對(duì)3份疫苗破乳水相的檢測(cè)結(jié)果顯示，口蹄疫O型滅活疫苗在O型抗原Mya98株測(cè)試卡為陽(yáng)性結(jié)果，口蹄疫A型滅活疫苗在A型抗原測(cè)試卡為陽(yáng)性結(jié)果，口蹄疫O型、A型二價(jià)滅活疫苗在兩種測(cè)試卡均為陽(yáng)性結(jié)果 (圖 6)。該抗原測(cè)試卡可對(duì)口蹄疫滅活疫苗中的O型和A型抗原進(jìn)行鑒定。

圖6 抗原測(cè)試卡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室自制疫苗Fig. 6 Antigen test results of vaccines formulated in lab. (A) Vaccine (Type O). (B) Vaccine (Type A). (C)Vaccine (Type O, Type A). Note: C means control lines;T means test lines; S means sample well.

2.8 疫苗樣品的測(cè)定

測(cè)定了4家企業(yè)各4個(gè)批次共16批疫苗樣品破乳水相中的抗原含量，結(jié)果顯示，16批疫苗均能檢出 146S抗原 (圖 7)。16批樣品的色譜結(jié)果存在差異，原因與各企業(yè)生產(chǎn)工藝不同有關(guān)，不同產(chǎn)品因生產(chǎn)工藝的差別，疫苗中146S的降解產(chǎn)物和雜蛋白含量不同，會(huì)對(duì)146S色譜峰產(chǎn)生不同程度的影響。將儀器自動(dòng)積分得到的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，即得抗原含量，效力檢驗(yàn)結(jié)果 (PD50)由企業(yè)提供，見(jiàn)表3。

圖7 疫苗樣品色譜圖Fig. 7 Chromatograms of vaccine samples. (A–D) Manufacturer code. (1–4) Different batches of vaccine.

表3 疫苗樣品測(cè)定結(jié)果Table 3 Detection results of vaccine samples

3 討論

純度高且穩(wěn)定的口蹄疫抗原標(biāo)準(zhǔn)品是該方法得以應(yīng)用的前提，口蹄疫病毒粒子的二十面體結(jié)構(gòu)非常不穩(wěn)定，在溫度高于56 ℃或pH低于6的條件下會(huì)裂解[12-14]，因此對(duì)146S抗原的純化制備工藝要求很高。本實(shí)驗(yàn)使用的純化樣品由中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所楊延麗等制備，制得后立即用于檢測(cè)。色譜條件的確定不僅依賴病毒粒子的特性，還需要考慮色譜柱的耐用范圍，本研究使用的TOSOH TSKgel色譜柱是目前較為常用的凝膠色譜柱，在后續(xù)耐用性研究中，可對(duì)同類型其他色譜柱進(jìn)行考察。在疫苗前處理中，通過(guò)比較不同試劑對(duì)疫苗的破乳效果，確定了正戊醇為破乳試劑。在部分口蹄疫滅活疫苗的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，雜質(zhì)會(huì)對(duì)146S抗原色譜峰產(chǎn)生影響，該問(wèn)題有望通過(guò)改進(jìn)生產(chǎn)工藝，降低雜蛋白含量、提高抗原穩(wěn)定性，以及進(jìn)一步優(yōu)化樣品前處理過(guò)程來(lái)解決。

本研究初步建立了一種口蹄疫滅活疫苗中146S抗原含量檢測(cè)的液相色譜分析方法。應(yīng)用該方法能夠快速、準(zhǔn)確地測(cè)定疫苗中有效抗原的含量。通過(guò)結(jié)合抗原測(cè)試卡，可進(jìn)一步對(duì)疫苗中抗原的血清型加以鑒別，以便全面地評(píng)價(jià)其質(zhì)量。與傳統(tǒng)的蔗糖或氯化銫密度梯度離心法相比，省去了過(guò)夜制備密度梯度離心管和長(zhǎng)時(shí)間的高速離心等復(fù)雜的操作過(guò)程，能夠顯著降低時(shí)間和人力成本。并且，疫苗破乳后可立即對(duì)水相進(jìn)行檢測(cè)，有效避免了146S抗原的損失，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。以上優(yōu)勢(shì)使該方法對(duì)疫苗生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量控制和工藝改進(jìn)具有重要應(yīng)用價(jià)值，并且對(duì)于口蹄疫滅活疫苗的質(zhì)量評(píng)價(jià)具有重要意義。相信隨著疫苗生產(chǎn)工藝的進(jìn)步、146S標(biāo)準(zhǔn)品的成功研制以及檢測(cè)方法的優(yōu)化和深入研究，該技術(shù)將有望替代本動(dòng)物免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)，成為控制口蹄疫疫苗質(zhì)量的有效技術(shù)手段，在降低生物安全風(fēng)險(xiǎn)、提高動(dòng)物福利、節(jié)約成本和提高環(huán)保效益等方面具有重要意義。

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