吳玨 裘佳寅 許璐 李錦 陳寧 潘亭亭 田亞平

惡性腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見、死亡率最高的原發(fā)性腦腫瘤，占顱腦腫瘤的40%～50%，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。侵襲和遷移行為是膠質(zhì)瘤細(xì)胞的重要特征，腦膠質(zhì)瘤向正常腦組織周圍彌漫性、浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，手術(shù)難以完全切除。因此，探索腦膠質(zhì)瘤侵襲和遷移的分子機(jī)制，尋找其潛在的治療分子靶點(diǎn)將有重要臨床意義。PARK2基因編碼的蛋白是一種E3泛素連接酶，參與生物體內(nèi)蛋白的泛素化修飾，并連接蛋白酶體降解系統(tǒng)，最初是作為常染色體隱性遺傳性少年型帕金森病的致病基因而被發(fā)現(xiàn)[2-5]。但它在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中侵襲遷移的生物學(xué)功能和可能的分子機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中構(gòu)建過(guò)表達(dá)PARK2細(xì)胞株，揭示PARK2影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移作用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

U138，A172，U251，U373，T98G細(xì)胞株均購(gòu)于ATCC細(xì)胞庫(kù)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO、胰酶等均購(gòu)于Gibco；PARK2抗體購(gòu)于CST公司； GAPDH抗體、二抗購(gòu)于Santa Cruz公司；載體pBABE-puro購(gòu)于Cell Biolabs Inc公司產(chǎn)品；Matrigel購(gòu)于Corning公司；Transwell小室購(gòu)于BD公司。

1.2 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建

選用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE-puro vector來(lái)構(gòu)建PARK2-WT的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞系。選擇狀態(tài)良好的細(xì)胞，將包裝好的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE-puro-PARK2病毒液轉(zhuǎn)染到腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，感染24～48 h后嘌呤霉素篩選陽(yáng)性克隆3 d，收集以上細(xì)胞株的蛋白，進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)PARK2在這些細(xì)胞中的蛋白的表達(dá)水平。

1.3 免疫印跡

RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞后，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上；用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉1 h；加入一抗（PARK2、EGFR和GAPDH稀釋倍數(shù)均為1：5 000），4℃過(guò)夜，TBST洗滌3次，每次15 min；分別加二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記）室溫孵育1 h；TBST洗滌3次，每次15 min；ECL顯色，醫(yī)用膠片顯影。

1.4 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

消化細(xì)胞種6孔板，具體數(shù)量因細(xì)胞不同而不同，掌握為過(guò)夜能鋪滿，復(fù)孔重復(fù)；37℃孵育細(xì)胞過(guò)夜；第2天6孔板中加入2 ml無(wú)抗無(wú)血清的培養(yǎng)基37°C孵育細(xì)胞過(guò)夜；24 h后等細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用200 μl 槍頭在6孔板上劃一個(gè)十字，槍頭要垂直，不能傾斜，PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基；放入37度5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，不同時(shí)間點(diǎn)拍照。

1.5 Transwell侵襲試驗(yàn)

使用50 mg/l Matrigel 1：8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃風(fēng)干；制備細(xì)胞懸液前，細(xì)胞撤血清饑餓12 h；消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗3遍，用含BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸；取細(xì)胞懸液200 μl加入Transwell小室；24孔板下室一般加入500 μl含F(xiàn)BS培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)12～48 h；用結(jié)晶紫染色，洗脫液洗脫，酶標(biāo)儀上570 nm 測(cè)其OD值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)至少3次以上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行處理，兩組間比較采用兩樣本Student’s t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中構(gòu)建過(guò)表達(dá)PARK2的穩(wěn)定細(xì)胞株

為研究PARK2對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲與遷移能力的影響，我們?cè)隗w外GBM細(xì)胞上分別利用慢病毒載體pCDH-CMV-MCSEF1-copGFP（過(guò)程參見材料和方法）上構(gòu)建了PARK2過(guò)表達(dá)細(xì)胞穩(wěn)定株，用于研究和觀察PARK2對(duì)GBM細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。首先，我們確認(rèn)PARK2在GBM細(xì)胞系的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)A172和U138細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平較高，U373、U251和T98G細(xì)胞蛋白表達(dá)都較低（圖1A）。然后，我們選擇在U251和T98G細(xì)胞中構(gòu)建了過(guò)表達(dá)PARK2穩(wěn)定株并通過(guò)Western-blot確定了細(xì)胞穩(wěn)定株的效果（圖1B）。

圖1 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PARK2的表達(dá)和穩(wěn)定過(guò)表達(dá)株的蛋白驗(yàn)證；A.PARK2在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況；B.構(gòu)建PARK2過(guò)表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株驗(yàn)證

圖2 過(guò)表達(dá)PARK2對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（P＜0.01）；A.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)PARK2對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251遷移能力的影響；B.Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)PARK2對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和T98G侵襲能力的影響

2.2 PARK2影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲

我們采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell invasion模型檢測(cè)PARK2對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。過(guò)表達(dá)細(xì)胞株U251-PARK2穩(wěn)定株進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)劃痕后連續(xù)觀察，PARK2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞向劃痕中央遷移的速度明顯減慢，在劃痕48 h后對(duì)照組的細(xì)胞已經(jīng)接近匯合處，而PARK2過(guò)表達(dá)組仍有較寬的劃痕存在，與轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)U251-PARK2的細(xì)胞遷移能力明顯低于對(duì)照組，如圖2所示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。接著，PARK2過(guò)表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和T98G穿過(guò)人工基底膜侵襲到小室底面的細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照組明顯減少（圖2），實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)PARK2可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

3 討論

PARK2基因編碼的蛋白是一種E3泛素連接酶，參與生物體內(nèi)蛋白的泛素化修飾，并連接蛋白酶體降解系統(tǒng)。目前研究發(fā)現(xiàn)PARK2的功能包括蛋白質(zhì)反轉(zhuǎn)、應(yīng)激反應(yīng)、體內(nèi)穩(wěn)態(tài)、異源吞噬、新陳代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)和生存等[6-10]。PARK2除廣泛存在于人類正常組織中，在多種腫瘤組織，如肺癌、胃癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、皮膚黑色素瘤等中存在體細(xì)胞PARK2失活的參與；PARK2缺失的小鼠可增加腫瘤發(fā)生的易感性；敲低PARK2可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤形成能力，而過(guò)表達(dá)PARK2可減少在體外或體內(nèi)各種組織起源的癌細(xì)胞的增長(zhǎng)，以上都顯著表明PARK2的腫瘤抑制作用[11-14]。但是PARK2在腫瘤中侵襲和轉(zhuǎn)移的行為還未曾明確。因此，為進(jìn)一步研究PARK2在腫瘤中的生物學(xué)功能，我們研究選擇了五種腦膠質(zhì)瘤的細(xì)胞系檢測(cè)PARK2的蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)了U373、U251、T98G表達(dá)量明顯低于U138和A172。于是我們選擇了U251和T98G細(xì)胞構(gòu)建PARK2野生型的過(guò)表達(dá)株用于PARK2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中生物學(xué)功能的研究。通過(guò)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和T98G上過(guò)表達(dá)PARK2觀察其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，并尋找可能的機(jī)制。通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)上調(diào)PARK2后細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯下降。因此，我們發(fā)現(xiàn)PARK2在膠質(zhì)瘤的侵襲和遷移中扮演著重要的角色，是腦膠質(zhì)瘤侵襲與遷移的重要因子。

[1] Lara-Velazquez M，Al-Kharboosh R，Jeanneret S，et al. Advances in Brain Tumor Surgery for Glioblastoma in Adults[J]. Brain Sci，2017，7（12）：166.

[2] Dove KK，Klevit RE. RING-Between-RING E3 Ligases:Emerging Themes amid the Variations [J]. J Mol Biol，2017，429（22）：3363-3375.

[3] Panicker N，Dawson VL，Dawson TM. Activation mechanisms of the E3 ubiquitin ligase parkin [J]. Biochem J，2017，474（18）：3075-3086.

[4] Seirafi M，Kozlov G，Gehring K. Parkin structure and function [J].FEBS J，2015，282（11）：2076-2088.

[5] Covill-Cooke C， Howden JH， Birsa N，et al. Ubiquitination at the mitochondria in neuronal health and disease [J]. Neurochemistry international，2017：1-10.

[6] Wang H，Jiang Z，Na M，et al. PARK2 negatively regulates the metastasis and epithelial-mesenchymal transition of glioblastoma cells via ZEB1 [J].Oncology letters，2017，14（3）：2933-2939.

[7] Lin DC，Xu L，Chen Y，et al. Genomic and Functional Analysis of the E3 Ligase PARK2 in Glioma [J]. Cancer Res，2015，75（9）：1815-1827.

[8] Wahabi K，Perwez A，Rizvi MA. Parkin in Parkinson's Disease and Cancer: a Double-Edged Sword [J]. Mol Neurobiol，2018（35）：1-13.

[9] Zhang CW，Hang L，Yao TP，et al. Parkin Regulation and Neurodegenerative Disorders [J]. Front Aging Neurosci，2015（7）：248.

[10] Xu L，Lin DC，，Yin D， et al. An emerging role of PARK2 in cancer [J]. J Mol Med （Berl）， 2014， 92（1）： 31-42.

[11] Aguirre JD， Dunkerley KM， Lam R，et al. Impact of altered phosphorylation on loss of function of juvenile Parkinsonismassociated genetic variants of the E3 ligase parkin [J]. J Biol Chem，2018，293（17）：6337-6348.

[12] Xiong D，Wang Y，You M. PARK2 gene and familial lung cancer： what is the link? [J]. Future Oncol， 2015，11（12）：1707-1710.

[13] da Silva-Camargo CCV， Svoboda Baldin RK， Costacurta Polli NL， et al. Parkin protein expression and its impact on survival of patients with advanced colorectal cancer [J]. Cancer Biol Med 2018，15（1）：61-69.

[14] Matsuda S， Nakanishi A， Minami A， et al. Functions and characteristics of PINK1 and Parkin in cancer [J]. Front Biosci（Landmark Ed）， 2015， 20（3）： 491-501.