張婷，陳妤，王文銀，李雪雁，馬建忠

蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，一些農(nóng)作物經(jīng)過(guò)幾代種植，品質(zhì)一般都同現(xiàn)不同程度的退化，在馬鈴薯、蔬菜、果樹(shù)、花卉等農(nóng)作物上表現(xiàn)得尤為突出。根據(jù)科學(xué)家的長(zhǎng)期研究，農(nóng)作物品質(zhì)衰退的原因主要是植物病毒的感染。為獲得高產(chǎn)，生產(chǎn)中就必須培養(yǎng)出無(wú)病毒苗，即脫毒苗。

草莓種植隨著設(shè)施栽培年限的延長(zhǎng)，以紅中柱根腐病、黃萎病、枯萎病為代表的土傳病害發(fā)生頻率增加，土壤連作障礙也成為制約產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸因子。草莓長(zhǎng)期使用無(wú)性繁殖種苗由于繁殖代數(shù)多，易使品種退化，葉子皺縮，生長(zhǎng)緩慢，果實(shí)逐年變小、畸形率高、品質(zhì)差，并逐年加重！另外長(zhǎng)期匍匐莖繁殖難免會(huì)傳染一些土傳病，病毒感染嚴(yán)重，抗病力減弱，產(chǎn)量、質(zhì)量，效益銳減。

植物組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)是草莓脫除病毒病的一種最有效的途徑之一。通過(guò)植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行草莓的脫毒與試管苗繁殖，縮短了草莓繁殖周期，去除體內(nèi)積累的病毒含量，保持親本的優(yōu)良性狀，提高了繁育能力和繁殖系數(shù)。

草莓鑲脈病毒（SVBV）是侵染草莓的主要病毒之一。雖然SVBV 侵染草莓的形態(tài)特征并無(wú)十分明顯的改變，但仍可導(dǎo)致草莓匍匐莖數(shù)量減少，草莓植株生長(zhǎng)衰弱，果實(shí)產(chǎn)量及品質(zhì)均下降等危害。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上為保持草莓品種的優(yōu)良性狀，通常采用無(wú)性繁殖途徑培養(yǎng)種苗，這使得病毒不斷積累、傳播。有研究表明，病毒病造成草莓每年減產(chǎn)達(dá)30%～80%。對(duì)草莓病毒病的防治，一是培育脫毒苗，二是建立嚴(yán)格有效的病毒檢測(cè)程序。本論文所分析的草莓樣品主要為本實(shí)驗(yàn)室收集的品種和多次赴甘肅省永靖縣草莓種植地采集的植株和葉片樣品。其中，一些樣品表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)不正常形態(tài)。比如：葉面不規(guī)則黃化成斑駁狀、植株矮化匍匐莖減少、葉面不規(guī)則壞死成枯斑、葉片邊緣有紅褐色、葉片褪綠黃化及葉片皺縮不平整等。

1. 材料與方法

1.1 材料

含鑲脈病毒草莓樣品取自甘肅省臨夏市永靖縣，陽(yáng)性對(duì)照為蘭州理工大學(xué)馬建忠實(shí)驗(yàn)室收集的草莓鑲脈病毒感染品種，大腸桿菌（Escherichia coli DH5α）同為本實(shí)驗(yàn)室收藏。

主要的分子生物學(xué)試劑：10×PCR緩沖液（100 mM Tris-HCl，pH 8.3，500 mM KCl，15 mM MgCl2）、DNA分子量標(biāo)志（DL 2000）、T4 DNA連接酶、10×T4 DNA 連接酶緩沖液（500mM Tris-HCl緩沖液，pH 7.8，100 mM MgCl2，10mM ATP，100 mM DTT）、RNase A、dNTP 混合液（25 mM dATP，25 mM dTTP，25 mM dCTP，25 mM dGTP）、rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）、pMD19（simple）T載體、6×上樣緩沖液（30mM EDTA，36% (V/V)Glycerol，0.05% (W/V) Xylene Cyanol FF，0.05% (W/V) Bromophenol Blue）等。所用酶制劑主要購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司。

主要儀器：移液器、PCR儀、電泳系統(tǒng)、紫外分光光度計(jì)、電熱壓力滅菌鍋、振蕩培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、臺(tái)式高速離心機(jī)、透射紫外觀察儀、低溫冰箱、水浴鍋、數(shù)碼相機(jī)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

除本實(shí)驗(yàn)室收集的草莓品種外，赴永靖縣草莓種植地采集生長(zhǎng)狀況正常和具有SVBV病毒侵染癥狀的草莓植株或葉片。將獲得的三株疑似含SVBV病毒草莓樣品命名為L(zhǎng)1、L2、L3。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提取SVBV核苷酸序列資料，用Oligo 7軟件設(shè)計(jì)了數(shù)對(duì)SVBV保守區(qū)的特異性PCR引物，交由生工公司（上海）合成。這對(duì)引物的核苷酸序列如下，上游引物（F1）：5' - CTAACTATCTTACACAGGGAAC；下游引物（R1）：5' -GTCCGATCTCATTACAAATCCA。

1.2.3 SVBV的PCR擴(kuò)增

以改良CTAB法提取樣品中的總DNA作為PCR的模板，分別用 引 物F1、R1進(jìn) 行 PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性90sec；之后執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94℃變性30sec、45℃退火30 sec、72℃延伸30 sec；最后72℃延伸5min。PCR結(jié)束后取5μL產(chǎn)物加入1μL 6×上樣緩沖液，上樣于1.2%瓊脂糖凝膠，100V電壓下電泳30～40min，之后置疑膠成像系統(tǒng)拍照。

2. 結(jié)果與分析

2.1 草莓鑲脈病毒感染樣品與脫毒苗總DNA PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

圖1： 疑似含草莓鑲脈病毒樣品DNA檢測(cè)與采得的疑似含草莓鑲脈病毒樣品DNA檢測(cè)

A：草莓鑲脈病毒感染樣品與脫毒苗總DNA PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果。DL 2000分子標(biāo)志；1：陽(yáng)性對(duì)照（草莓鑲脈病毒感染樣品基因組PCR電泳結(jié)果）；2：脫毒苗基因組PCR電泳結(jié)果。

B：采得的疑似含草莓鑲脈病毒樣品DNA檢測(cè)。 M：DL 2000分子標(biāo)志；1～3：獲得的三株疑似含草莓鑲脈病毒樣品，分別為L(zhǎng)1、L2、L3。

經(jīng)PCR擴(kuò)增，1.2 %瓊脂糖凝膠電泳后，樣品L1、L2、L3得到了專(zhuān)一的擴(kuò)增產(chǎn)物帶，帶的大小與預(yù)期大?。?18bp）完全一致。據(jù)此初步判斷，三個(gè)來(lái)自永靖縣的草莓樣品種（L1、L2、L3）帶有SVBV。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，所設(shè)計(jì)引物F1、R1可以專(zhuān)一性檢測(cè)出草莓SVBV病毒，建立了快速有效的草莓鑲脈病毒檢測(cè)方法。從而誘導(dǎo)脫毒苗，繁育無(wú)毒品種，提高果實(shí)品質(zhì)及產(chǎn)量。草莓脫毒苗具有產(chǎn)量高：每株開(kāi)花數(shù)多，花序數(shù)、坐果率平均增加50%左右；果形好：果子外觀好，色澤鮮紅，均勻整齊，果子大，無(wú)畸形果；

果期長(zhǎng)：邊成熟邊開(kāi)花，經(jīng)久不衰。結(jié)果期一般延長(zhǎng)20-25天，有利于分批上市，減少積壓損失；生長(zhǎng)快：脫毒苗生長(zhǎng)快，長(zhǎng)勢(shì)旺，莖葉粗壯，繁殖系數(shù)高，推廣速度快；繁育力強(qiáng)：草莓脫毒苗結(jié)果后還可繁殖出20-50倍以上的種苗，供大面積應(yīng)用或出售；效益高：草莓脫毒苗在生產(chǎn)上極明顯的增產(chǎn)效益可連續(xù)保持三年以上，可繁殖出大量脫毒一代，二代和三代苗，因此是一年投資、多年受益等特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)于草莓SVBV病毒脫毒苗的培育具有重要的理論意義和生產(chǎn)指導(dǎo)意義。