陳明 穆凱熱姆·阿卜來(lái)提 劉政 王曉東

摘要：為提高鏈霉菌菌株LG-9發(fā)酵液的抑菌活性，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Minitab軟件中的Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析，以發(fā)酵液對(duì)棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae）的抑菌圈大小為響應(yīng)值，對(duì)鏈霉菌LG-9的液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，菌株LG-9的最佳發(fā)酵條件為250 mL三角瓶裝樣量101.19 mL、培養(yǎng)基初始pH 7.2、接種量7.5%、溫度31.32 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min和搖培時(shí)間69.02 h。在此條件下的抑菌圈直徑大小為22.45 mm，較未優(yōu)化前提高10.43%。

關(guān)鍵詞：棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae）；鏈霉菌；響應(yīng)面分析；發(fā)酵條件優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TQ920.1；S435.621 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）08-0071-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.08.019

Optimization of Fermentation Conditions for Anti-streptomyces LG-9 Using Response Surface Methodology and Its Inhibiton on Verticillium dahliae

CHEN Ming1，MUKARAM Ablat1，LIU Zheng2，WANG Xiao-dong1

（1.College of Agronomy，Shihezi University/Key Laboratory of Oasis Crop Disease Prevention and Control，Shihezi 832000，Xinjiang，China；

2.Institute of Plant Protection，Shihezi Academy of Agricultural Sciences，Shihezi 832000，Xinjiang，China）

Abstract： In order to improve the antibacterial activity of Streptomyces isolate LG-9，on the basis of single factor test，using the Plackett-Burman experiment design and response surface analysis of Minitab software，with the inhibition circle size of the fermentation broth on Verticillium dahliae as the response value，and the liquid fermentation condition of Streptomyces LG-9 were optimized. The results showed that the optimal fermentation conditions of the strains LG-9 were loading volume of liquid medium 101.19 mL in 250 mL triangle bottle，pH 7.2，inoculation amount of 7.5%，temperature 31.32 ℃，rotate 160 r/min，time 69.02 h. The diameter of the inhibition zone under these conditions was 22.45 mm，which was 10.43% higher than that before optimization.

Key words： Verticillium dahliae； streptomyces； response surface analysis； optimization of fermentation conditions

棉花黃萎病是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）引起的土傳維管束病害，病原菌寄主范圍廣、危害重且缺乏有效的防治手段，被稱為棉花的“癌癥”。利用拮抗微生物來(lái)防治棉花黃萎病已經(jīng)成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1]?！耙跃尉钡纳锓乐螌?duì)環(huán)境友好，無(wú)殘留，作物不易產(chǎn)生抗藥性，有些生防微生物還能促進(jìn)農(nóng)作物的生長(zhǎng)。目前，防治棉花黃萎病報(bào)道最多的生防微生物有細(xì)菌[2，3]、真菌[4，5]和放線菌[6-8]。其中，放線菌是一類數(shù)量大、種類多、具有重要實(shí)用價(jià)值和開(kāi)發(fā)潛力的微生物資源，是非常重要的生物活性物質(zhì)的來(lái)源，迄今從微生物中發(fā)現(xiàn)的大約12 000多種生理活性物質(zhì)中，有近2/3是放線菌產(chǎn)生的[9]，其中鏈霉菌是產(chǎn)生活性物質(zhì)的主要菌屬，約占總數(shù)的一半。在放線菌的生防利用中，通過(guò)液體發(fā)酵，產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物是最常見(jiàn)的。由于不同微生物的生理生化特性不同，所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境條件也不相同。因此，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的種類、合理的濃度配比及適宜培養(yǎng)條件的優(yōu)化對(duì)微生物正常生長(zhǎng)及目標(biāo)代謝物質(zhì)的產(chǎn)生起著關(guān)鍵性的作用。發(fā)酵條件的優(yōu)化在微生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中占舉足輕重的地位，是微生物產(chǎn)品從實(shí)驗(yàn)室到工業(yè)生產(chǎn)轉(zhuǎn)化的必要環(huán)節(jié)。

響應(yīng)面法（Response Surface Methodology，RSM）是由Box和Wilson在1950年最早提出來(lái)的用于獲得最優(yōu)試驗(yàn)條件的方法，是數(shù)學(xué)方法和統(tǒng)計(jì)方法結(jié)合的產(chǎn)物，最初應(yīng)用在化學(xué)和化學(xué)工程領(lǐng)域[10]，隨后，RSM也被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)，研究反應(yīng)混合物中各反應(yīng)成分所占比例與其生物學(xué)活性之間的關(guān)系，確定生物材料的最優(yōu)試驗(yàn)條件[11]。

石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室篩選出一株對(duì)棉花黃萎病原菌有顯著抑菌效果的鏈霉菌菌株LG-9，利用常規(guī)基礎(chǔ)培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基在培養(yǎng)條件單因子優(yōu)化試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burmam設(shè)計(jì)[12]、最陡爬坡路徑實(shí)驗(yàn)[13]和響應(yīng)面分析法中的Box-Behnken設(shè)計(jì)[14]相結(jié)合對(duì)鏈霉菌LG-9菌株液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高發(fā)酵液的抑菌活性，為后續(xù)LG-9發(fā)酵液有效抑菌組分的鑒定及田間防效試驗(yàn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 鏈霉菌菌株LG-9分離自新疆棉田根際土壤，經(jīng)過(guò)平板對(duì)峙，證明該菌株對(duì)棉花黃萎病菌具有顯著拮抗活性，將該菌株接種于高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基，4 ℃保存。棉花黃萎病菌菌株301-3由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、KNO3 1 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂粉15 g、去離子水1 000 mL，pH 7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：小米10.0 g、葡萄糖10.0 g、蛋白胨3.0 g、NaCl 2.5 g、CaCO3 2.5 g、去離子水1 000 mL，pH 7.2。

馬鈴薯瓊脂葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）和馬鈴薯瓊脂葡萄糖培養(yǎng)液（PDB）、高氏一號(hào)培養(yǎng)基參考方中達(dá)[15]描述的方法制備。以上培養(yǎng)基均121 ℃滅菌30 min后備用。

1.2 方法

1.2.1 供試菌株活化與種子液的制備 將冷藏菌株LG-9接種于高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，28 ℃活化4 d，挑取菌絲塊接種于裝有100 mL高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，160 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)4 d。

1.2.2 發(fā)酵粗提液的制備 鏈霉菌菌株LG-9在Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡路徑試驗(yàn)和優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)中獲得發(fā)酵液，經(jīng)10 000 r/min離心20 min，取其上清液經(jīng)無(wú)菌微孔濾膜（孔徑0.45 μm）過(guò)濾，過(guò)濾液為發(fā)酵粗提液，并保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.3 發(fā)酵粗提液抑菌活性測(cè)定 采用瓊脂擴(kuò)散法[16]進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。供試棉花黃萎病菌菌株301-3經(jīng)活化后，挑取生長(zhǎng)良好的菌絲塊，接種于PDB中，28 ℃振蕩培養(yǎng)3 d后，用4層無(wú)菌紗布過(guò)濾，配制成1×107 CFU/mL孢子懸浮液，吸取100 μL孢子懸浮液涂布于PDA平板上，晾干表面后，用無(wú)菌打孔器（5 mm）進(jìn)行打孔，每皿均勻分布3個(gè)孔，將不同處理的發(fā)酵粗提液注入孔中，每孔100 μL。28 ℃下培養(yǎng)3 d后，觀察其抑菌情況，并采用十字交叉法測(cè)量和記錄抑菌圈直徑。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單因素選擇 利用基礎(chǔ)培養(yǎng)液，選擇發(fā)酵時(shí)間、轉(zhuǎn)速、接種量、溫度、裝樣量以及pH對(duì)LG-9發(fā)酵液抑菌活性的影響作為Plackett-Burman試驗(yàn)的因子。

1.3.2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在Plackett-Burmam試驗(yàn)設(shè)計(jì)（PB設(shè)計(jì)）中，每個(gè)因子取2個(gè)水平，以-1和1編碼，低水平為原始培養(yǎng)條件，高水平約取低水平的1.25倍。設(shè)置6個(gè)主效因子和3個(gè)空項(xiàng)因子，試驗(yàn)次數(shù)N=12的Plackett-Burmam試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以C、F、I作為空項(xiàng)以估計(jì)試驗(yàn)誤差，A、B、D、E、G、H分別代表時(shí)間（h）、轉(zhuǎn)速（r/min）、接種量（%）、溫度（℃）、裝樣量（mL/250 mL）和pH。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.3.3 最陡爬坡路徑試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計(jì)結(jié)果的評(píng)價(jià)效應(yīng)，確定重要因子的最適范圍。以試驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?，其他因子根?jù)效應(yīng)系數(shù)的正負(fù)來(lái)確定，正系數(shù)選取較高值，負(fù)系數(shù)選取較低值[17]，同時(shí)測(cè)定不同處理發(fā)酵液粗提液的抑菌活性，確定關(guān)鍵因子的最優(yōu)范圍。

1.3.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果確定3個(gè)關(guān)鍵因素的最適范圍，以250 mL三角瓶裝樣量100 mL，接種量7.5%，溫度28 ℃為中心點(diǎn)進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)3因子3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，中心點(diǎn)設(shè)置3次重復(fù)，用Minitab16軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)擬合，求得最優(yōu)值，最后依據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面分析圖。

1.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 用最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，取平均值，以驗(yàn)證模型是否可靠，進(jìn)而得出最終優(yōu)化結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)

由表2、表3可知，對(duì)菌株LG-9發(fā)酵粗提液抑菌活性具有明顯影響的因子表現(xiàn)為E>A>G，即溫度>時(shí)間>裝樣量，它們的P分別為0.032、0.051和0.053，均對(duì)發(fā)酵粗提液抑菌活性的影響大于90%，因此選擇這3個(gè)因素作為下一步試驗(yàn)的關(guān)鍵因素。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

溫度、時(shí)間和裝樣量是影響發(fā)酵粗提液抑菌活性的關(guān)鍵因素，其中溫度對(duì)抑菌活性是負(fù)效應(yīng)，應(yīng)依次減小，時(shí)間和裝樣量對(duì)抑菌活性是正效應(yīng)，應(yīng)依次增大。由表4可知，隨著溫度的減小、時(shí)間和裝樣量的增加，抑菌活性呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為31 ℃，時(shí)間為72 h，250 mL三角瓶裝樣量為100 mL時(shí)，抑菌活性最大，為3個(gè)因素的最大響應(yīng)值區(qū)域，因此，以此為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2.3 Box-Behnken試驗(yàn)

確定3個(gè)關(guān)鍵因子的最適范圍后，以溫度31 ℃，時(shí)間72 h，250 mL三角瓶裝樣量100 mL為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面分析，各變量水平見(jiàn)表5，Box-Behnken設(shè)計(jì)3因子3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，中心點(diǎn)設(shè)置3次重復(fù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表6、表7。

用Minitab16軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得出模型回歸方程：

Y=-456.228+2.325 40X1+22.106 0X2+0.444 977

X3-0.010 140 7X12-0.351 667X22-0.004 272 12X32-

0.006 333 33X1X2-0.001 083 33X1X3+0.008 125 00X2X3。

從表7可以看出，模型平方的影響是顯著的，線性和交互作用的影響不顯著。二次模型多元相關(guān)性系數(shù)R2=0.939 5，R2調(diào)整值為0.830 5，P（Prob>F）=0.014，表明該模型是顯著的，回歸模型失擬項(xiàng)P=0.119>0.05，說(shuō)明模型擬合程度較好且失擬不顯著，模型穩(wěn)定，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值間具有高度的相關(guān)性，能進(jìn)行較好地預(yù)測(cè)。

根據(jù)上述擬合回歸方程，利用軟件繪制響應(yīng)面及等高線（圖1、圖2、圖3）。從圖1、圖2、圖3可以看出，裝樣量、溫度、時(shí)間三者存在顯著的相關(guān)性。由圖1可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間固定為最優(yōu)69.02 h，溫度固定在某一水平，裝樣量在85～115 mL時(shí)，發(fā)酵液抑菌圈呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)；由圖2可知，當(dāng)溫度固定為最優(yōu)31.32 ℃，裝樣量固定在某一水平，發(fā)酵時(shí)間在54～90 h時(shí)，發(fā)酵液抑菌圈呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)；圖3顯示，當(dāng)裝樣量固定為最優(yōu)101.19 mL，時(shí)間固定在某一水平，溫度固定在29～33 ℃時(shí)，發(fā)酵液抑菌圈呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，曲面的頂點(diǎn)即為最大抑菌圈值點(diǎn)。

2.4 最優(yōu)條件驗(yàn)證

由以上模型得出，當(dāng)250 mL三角瓶裝樣量為101.19 mL、溫度為31.32 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min、接種量7.5%、初始培養(yǎng)液pH 7.2、搖菌培養(yǎng)時(shí)間為69.02 h時(shí)，預(yù)測(cè)的抑菌圈直徑最大響應(yīng)值為22.93 mm。在此條件下對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，試驗(yàn)重復(fù)3次，抑菌圈直徑分別為22.25、22.42、22.67 mm，平均值為22.45 mm，與預(yù)測(cè)值接近，證實(shí)了模型的有效性。

3 小結(jié)與討論

微生物發(fā)酵產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的重要環(huán)節(jié)之一是培養(yǎng)條件的優(yōu)化。通過(guò)改進(jìn)發(fā)酵條件，可以促進(jìn)發(fā)酵過(guò)程朝著提高目的產(chǎn)物的方向進(jìn)行，縮短發(fā)酵周期，降低發(fā)酵成本，使投入產(chǎn)出比達(dá)到最小，以利于工業(yè)化生產(chǎn)[18，19]。本研究通過(guò)PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)，從6個(gè)影響鏈霉菌LG-9發(fā)酵液抑菌活性的因素中確定3個(gè)明顯影響因素為溫度、時(shí)間和裝樣量，后利用最陡爬坡法和Box-Behnken設(shè)計(jì)得出菌株LG-9最佳液體發(fā)酵條件為250 mL三角瓶裝樣量101.19 mL、pH 7.2、接種量7.5%、溫度31.32 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min、搖菌培養(yǎng)69.02 h，在此條件下的抑菌圈直徑為22.93 mm，且由回歸方程得到的最大預(yù)測(cè)值與驗(yàn)證值非常接近，說(shuō)明回歸方程能較真實(shí)地反映實(shí)際情況，因此，用響應(yīng)面法優(yōu)化LG-9發(fā)酵條件是有效可行的。

拮抗微生物發(fā)酵液的抑菌活性與代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量是密切相關(guān)的，不同發(fā)酵條件可顯著影響代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，進(jìn)而影響其抑菌活性，表現(xiàn)為抑菌圈直徑和面積的大小等[20，21]。在試驗(yàn)中，對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化是提高抑菌活性的有效手段。微生物培養(yǎng)優(yōu)化常用的方法有單因素和正交試驗(yàn)，單因素試驗(yàn)只是考察某一影響因素在一定范圍內(nèi)對(duì)目標(biāo)值的影響，不考慮多個(gè)影響因素間的交互作用，進(jìn)而難以獲得最優(yōu)結(jié)果[22]。正交試驗(yàn)?zāi)艿玫阶罴岩蛩厮降慕M合，同時(shí)考慮多種因素間的交互作用，但會(huì)增加試驗(yàn)次數(shù)，且對(duì)于不顯著因素的選取一般是憑經(jīng)驗(yàn)。液體發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的生物過(guò)程，各因素對(duì)目標(biāo)值的影響可能不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。響應(yīng)面分析法是一種綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，可考察影響因素之間的交互作用，并有效減少試驗(yàn)次數(shù)。同時(shí)，響應(yīng)面法還克服了正交試驗(yàn)不能給出直觀圖形的缺陷，可直接通過(guò)回歸方程模型得出顯著因素間交互作用的三維立體響應(yīng)曲面和等高線圖，直觀反映影響因子的影響趨勢(shì)[23]。目前，RSM被廣泛應(yīng)用于微生物發(fā)酵的優(yōu)化篩選中[24-27]。鄭虹等[28]優(yōu)化鏈霉菌D-8菌株發(fā)酵工藝，使抑菌圈直徑較優(yōu)化前提高了2.21倍。本試驗(yàn)在通過(guò)RSM獲取的優(yōu)化發(fā)酵條件下，使菌株LG-9發(fā)酵粗提液的抑菌圈直徑為22.45 mm，未優(yōu)化發(fā)酵條件下，抑菌圈直徑為20.33 mm，驗(yàn)證優(yōu)化后發(fā)酵較未優(yōu)化發(fā)酵菌株LG-9抑菌圈的直徑提高了10.43%。首先利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)，得出對(duì)鏈霉菌LG-9發(fā)酵粗提液抑菌活性具有明顯影響的因子為溫度、時(shí)間、裝樣量，后利用Box-Behnken設(shè)計(jì)得出模型回歸方程，在回歸分析中發(fā)現(xiàn)，裝樣量的二次項(xiàng)（P<0.01）及溫度和時(shí)間的二次項(xiàng)（P<0.05）均顯著影響鏈霉菌LG-9發(fā)酵粗提液的抑菌活性，推測(cè)這可能與LG-9菌株的好氧性及其抑菌活性物質(zhì)對(duì)溫度和時(shí)間的穩(wěn)定性有關(guān)。本研究中菌株LG-9產(chǎn)生的抑黃萎病菌物質(zhì)屬性及生防機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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