郭春暉 寧昌龍 王蕊蕊 吳廣 趙鵬飛 楊丙燁 楊振德

摘要：為了解植物源農(nóng)藥對鞘翅目昆蟲呼吸代謝和保護(hù)酶活性的影響，以黃粉蟲（Tenebrio molitor）8齡幼蟲為研究對象，以印楝素為供試農(nóng)藥，采用飼喂法測定印楝素對黃粉蟲末齡幼蟲CO2釋放率和保護(hù)酶活性的變化。結(jié)果表明，印楝素處理后，黃粉蟲的CO2釋放率和保護(hù)酶活性均先升高后迅速下降。攝入印楝素6 h后，黃粉蟲的CO2釋放率達(dá)到最大值，為13.2 μL/h，之后迅速下降并顯著低于對照；保護(hù)酶SOD、CAT和POD活性在6 h時(shí)達(dá)到最大，分別是對照的2.34、2.91和1.98倍，其后呈現(xiàn)下降趨勢。

關(guān)鍵詞：印楝素；黃粉蟲（Tenebrio molitor）；呼吸；保護(hù)酶

中圖分類號：S433 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）08-0055-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.08.014

Effects of Azadirachtin on Respiration and Protective Enzymes Activity of Tenebrio molitor Larvae

GUO Chun-hui1，NING Chang-long2，WANG Rui-rui1，WU Guang1，ZHAO Peng-fei1，YANG Bing-ye3，YANG Zhen-de1

（1.College of Forestry，Guangxi University，Nanning 530001，China；2.Guangxi Liuwan State-owned Forest Farm，Yulin 537000，Guangxi，China；

3.College of Plant Protection，F(xiàn)ujian Agriculture and Forest University，F(xiàn)uzhou 350002，China）

Abstract： To investigate the effects of botanical pesticide on the respiration and protective enzymes of coleopteran，CO2 release rate and protective enzymes in the 8th instar larvae of Tenebrio molitor fed with azadirachtin were examined. The results showed that the CO2 release rate and protective enzymes of T. molitor fed with azadirachtin increased initially and then declined rapidly. The highest CO2 release rate of T. molitor was 13.2 μL/h after 6 hours of feeding with azadirachtin and then fell quickly，remarkably lower than the value of control groups. The maximum activities of protective enzymes including SOD，CAT and POD appeared after 6 hours of feeding with azadirachtin， which were 2.34，2.91 and 1.98 times than those in the control group，respectively. And these protect enzymes lowered fast subsequently.

Key words： azadirachtin； Tenebrio molitor； respiratory； protective enzymes

殺蟲劑的應(yīng)用是防治害蟲的重要手段之一。但隨著有機(jī)合成農(nóng)藥的弊端日益明顯，急需新的、安全性高的藥劑代替有機(jī)合成農(nóng)藥來保障農(nóng)作物的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。印楝素（Azadirachtin）是從印楝（Azadirachta indica A. Juss.）中提取的一種三萜類化合物，對多種昆蟲具有忌避、觸殺、拒食和抑制生長發(fā)育等作用[1]。其殺蟲范圍廣、對高等動(dòng)物毒性低、不易產(chǎn)生抗藥性、在環(huán)境中能迅速而徹底地降解以及對天敵安全，因此印楝素殺蟲劑已成為有發(fā)展前景的植物源農(nóng)藥[2，3]。

黃粉蟲（Tenebrio molitor Linnaeus）又稱大黃粉蟲、黃粉甲，俗稱“面包蟲”。隸屬于昆蟲綱（Insecta）鞘翅目（Coleoptera）擬步甲科（Tenebrionidae）粉甲屬（Tenebrionini）[4]。其體內(nèi)含有豐富的糖類、脂肪、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、氨基酸和多種對人類有益的微量元素[5，6]。目前關(guān)于黃粉蟲的研究大都集中在資源利用等方面，如對其所含營養(yǎng)物質(zhì)蛋白、黃酮等的提取及利用[7，8]。然而，在自然環(huán)境中黃粉蟲大多出現(xiàn)于各種農(nóng)林產(chǎn)品的庫房中，其幼蟲食性雜，并且能夠以一切有營養(yǎng)的物質(zhì)為食，是一種大型的倉儲(chǔ)害蟲[9]。在重視黃粉蟲經(jīng)濟(jì)價(jià)值的同時(shí)也不能忽視對黃粉蟲的防治，因此，本研究以黃粉蟲8齡幼蟲為供試蟲源，研究印楝素對黃粉蟲呼吸代謝和保護(hù)酶的影響，為這類害蟲的安全防治提供參考，也為印楝素的合理使用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蟲源：黃粉蟲購自南寧市花鳥市場，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至第2代8齡時(shí)使用。飼養(yǎng)條件：溫度（25±1） ℃，相對濕度20%±5%，光周期L∶D=12 h∶12 h。飼料由麥麩和蘋果按9∶1比例配成。供試藥劑為0.3%印楝素乳油（云南中科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 試蟲處理 用75%乙醇將印楝素配制成200 mg/L溶液，將配好的印楝素乙醇溶液按體積比1∶1浸泡麥麩，置于陰暗處讓乙醇完全蒸發(fā)。挑選大小、體重相近的剛蛻皮的8齡幼蟲，每組20只，設(shè)3次重復(fù)，饑餓處理12 h后，用上述印楝素處理的飼料喂養(yǎng)，以未用印楝素處理的飼料飼養(yǎng)的8齡幼蟲為對照。

1.2.2 CO2釋放率的測定 采用多通道昆蟲呼吸儀組成呼吸信號采集系統(tǒng)（Sable System International Inc.（USA））測定對照和取食0、6、12、24、72 h后的CO2釋放量。呼吸室氣流速度設(shè)置為125 mL/min，測試前將供試幼蟲靜置30 min以適應(yīng)環(huán)境，待幼蟲的CO2釋放量平穩(wěn)后開始測定，每隔2 s記錄1次數(shù)據(jù)，每頭試蟲連續(xù)測定10 min，數(shù)據(jù)自動(dòng)記錄到EXPADATA的程序軟件中，每個(gè)處理測定幼蟲10頭，即10個(gè)重復(fù)。

1.2.3 保護(hù)酶活性的測定 將對照和取食0、6、12、24、72 h后的黃粉蟲加入0.1 mol/L pH=7.0的磷酸緩沖液，冰浴研磨，勻漿在12 000 r/min離心15 min，取上層清液為粗酶提取液，并在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。超氧化物歧化酶（SOD）參照李周直等[10]的方法測定；過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法[11]測定；過氧化物酶（POD）活性按改進(jìn)的Simon等[12]方法測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析數(shù)據(jù)，用最小顯著差數(shù)法（LSD）分析測得數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO2釋放率的變化

印楝素處理后黃粉蟲CO2釋放率變化見圖1。由圖1可知，最初短暫升高，6 h時(shí)CO2釋放率達(dá)到最大，為13.2 μL/h，之后迅速下降，并顯著低于對照。

2.2 保護(hù)酶活性的變化

印楝素處理后黃粉蟲體內(nèi)保護(hù)酶活性變化見圖2。由圖2可知，6 h之內(nèi)保護(hù)酶活性迅速升高，其中，超氧化物歧化酶（SOD）活性最高值為對照的2.34倍（圖2A），過氧化氫酶（CAT）活性最大值為對照的2.91倍（圖2B），過氧化物酶（POD）活性是對照的1.98倍（圖2C）；其后3種保護(hù)酶活性快速下降，12 h后均顯著低于對照，72 h時(shí)最弱，分別為10.05、126.76、142.65 μmol/s。

3 小結(jié)與討論

溫度[13-15]、體重[16]、性別[17]、發(fā)育階段[18]以及農(nóng)藥[19，20]等條件會(huì)對昆蟲的呼吸代謝和保護(hù)酶活性產(chǎn)生影響。研究表明，苦豆草生物堿處理后，分月扇舟蛾（Clostera anastomosis）和柳藍(lán)葉甲（Plagiodera versicolora）體內(nèi)的保護(hù)酶活性先升高后下降[21，22]；菜青蟲（Pieris rapae）取食川楝素后，其呼吸強(qiáng)度顯著減弱，多種酶活性受到抑制[23，24]；朱砂葉螨（Tetranychus cinnabarinus）經(jīng)阿維菌素處理4 h后，其體內(nèi)保護(hù)酶活性明顯上升[25]；中華稻蝗（Oxya chinensis）若蟲受印楝素處理后CO2釋放率明顯下降[26]。昆蟲依靠體內(nèi)的呼吸及保護(hù)酶系統(tǒng)來適應(yīng)不同殺蟲劑的毒性，通過測定昆蟲的呼吸代謝和保護(hù)酶研究昆蟲對農(nóng)藥的抗性機(jī)理，對提高殺蟲劑的殺蟲效率具有重要意義。

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，攝入印楝素后，黃粉蟲的CO2釋放率迅速升高，6 h達(dá)到最大，之后迅速下降，這與侯建虎等[27]研究茚蟲威對小菜蛾（Plutella xylostella）呼吸代謝的結(jié)果一致。SOD、CAT和POD是昆蟲體內(nèi)最重要的保護(hù)酶，其中SOD能夠催化超氧化物的陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，產(chǎn)生O2和H2O2[28]，CAT和POD能夠把SOD催化生成的H2O2分解成O2和H2O[29]。這3種保護(hù)酶相互協(xié)調(diào)，能夠清除昆蟲體內(nèi)多余的過氧化物自由基或活性氧，提高生物體對逆境的防御，一旦保護(hù)酶系受到破壞，會(huì)使生物體內(nèi)氧自由基過度升高，使細(xì)胞受到傷害[10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，取食印楝素處理的飼料后，黃粉蟲體內(nèi)的SOD、CAT和POD活性先升高后下降，這與楊振德等[22]報(bào)道苦豆草生物堿對柳藍(lán)葉甲（Plagiodera versicolora）保護(hù)酶活性變化的結(jié)果一致。由于攝入印楝素后，昆蟲會(huì)產(chǎn)生拒食反應(yīng)[30]。黃粉蟲在取食印楝素后，為維持其體內(nèi)正常生命活動(dòng)，必須加強(qiáng)體內(nèi)的物質(zhì)分解來提供能量，造成黃粉蟲的CO2釋放率和保護(hù)酶活性短暫升高，但隨著拒食時(shí)間的延長，黃粉蟲無法獲得足夠的能量，其體內(nèi)生理平衡受到嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致CO2釋放率和保護(hù)酶活性迅速下降。

隨著社會(huì)的發(fā)展，人們對于農(nóng)藥環(huán)境安全和生態(tài)問題的關(guān)注度不斷提高，以印楝素為代表的植物源農(nóng)藥在未來會(huì)受到更加廣泛的關(guān)注。本研究結(jié)果表明，印楝素可以干擾黃粉蟲的呼吸代謝，降低其體內(nèi)多種保護(hù)酶活性，從而影響其正常的生理代謝而實(shí)現(xiàn)殺蟲效果。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張懷江，王 秀，仇貴生，等.印楝素乳油對梨小食心蟲的防控效果研究[J].應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào)，2016，53（5）：1012-1017.

[2] MITCHELL P L，GUPTA R，SINGH A K，et al. Behavioural and developmental effects of neem extracts on Clavigralla scutellaris （Hemiptera：Heteroptera：Coreidae） and its egg parasitoid，Gryon Fulviventre（Hymenoptera：Scelionidae）[J].Journal Economic Entomology，2004，97：916-923.

[3] SCHMUTTERER H. Properties and potential of natural pesticides from the neem tree，Azadirachta indica[J].Annual Reviews of Entomology，1990，35：271-297.

[4] 劉玉升，王付彬，崔俊霞，等.黃粉蟲資源研究利用現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2010，32（1）：106-114.

[5] ZHAO D J. Nutritional component and edible value of Tenebrio molitor L[J].Food and Oil Science and Technology，2000，8（2）：41-42.

[6] FENG Y B. Mensuration and research of inorganic elements and vitamins of Tenebrio molitor L[J].Food Research and Development，2002，23（2）：57-59.

[7] 代春華.黃粉蟲幼蟲蛋白酶解制備降血壓肽的研究[D].江蘇無錫：江南大學(xué)，2012.

[8] 汪 璇，張建新，孫長江，等.響應(yīng)面法優(yōu)化黃粉蟲黃酮提取工藝[J].食品科學(xué)，2013，34（4）：11-16.

[9] 王學(xué)貴，鄭曉薇，李曉宇，等.溫度對黃粉蟲生物學(xué)特性的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（8）：230-233.

[10] 李周直，沈惠娟，蔣巧根，等.幾種昆蟲體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)活力的研究[J].昆蟲學(xué)報(bào)，1994，37（4）：399-403.

[11] BEERS R F，SIZER I W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase[J].Journal of Biological Chemistry，1952，195（1）：133-140.

[12] SIMON DR L M，F(xiàn)ATRAI DR Z，JONAS DR D E，et al. Study of peroxide metabolism enzymes during the development of Phaseolus vulgris[J].Biochem Physiol Pflanzen，1974，166：387-392.

[13] 王冬梅，李 娟，李 爽，等.溫度對意大利蝗呼吸代謝的影響[J].昆蟲學(xué)報(bào)，2014，57（3）：373-378.

[14] 陳愛端，李克斌，尹 姣，等.環(huán)境因子對溝金針蟲呼吸代謝的影響[J].昆蟲學(xué)報(bào)，2011，54（4）：397-403.

[15] 郭春暉，王蕊蕊，楊丙燁，等.溫度對綠翅絹野螟4齡幼蟲CO2釋放率的影響[J].仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2017，30（3）：57-59.

[16] 戈 峰，陳常銘.褐飛虱和八斑球腹蛛的呼吸代謝及其能量消耗[J].昆蟲學(xué)報(bào)，1990，33（1）：35-42.

[17] 吳坤君，龔佩瑜.棉鈴蟲成蟲期的呼吸代謝[J].昆蟲學(xué)報(bào)，1984， 27（2）：128-135.

[18] GREENLEE K J，HARRISON J F. Development of respiratory function in the American locust Schistocerca americana[J].The Journal of Experimental Biology，2004，207（3）：509-517.

[19] 孫魯娟，吳孔明，郭予元.棉鈴蟲幼蟲感染白僵菌后呼吸速率和食物利用效率的變化[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2000，27（4）：322-326.

[20] 侯建虎，周小毛，柏連陽，等.茚蟲威對不同抗藥性品系小菜蛾呼吸代謝的影響[J].應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào)，2012，49（2）：471-476.

[21] 楊振德，朱 麟，趙博光，等.苦豆草生物堿對分月扇舟蛾體內(nèi)消化酶和保護(hù)酶活性的影響[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006， 28（1）：80-83.

[22] 楊振德，朱 麟，趙博光，等.苦豆草生物堿對柳藍(lán)葉甲體內(nèi)消化酶、酯酶和保護(hù)酶活性的影響[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2007， 22（1）：81-83，86.

[23] 張 興，趙善歡.川楝素對菜青蟲呼吸作用及其它幾種生理指標(biāo)的影響[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1992，13（2）：5-11.

[24] 張 興，趙善歡.川楝素對菜青蟲體內(nèi)幾種酶系活性的影響[J].昆蟲學(xué)報(bào)，1992，35（2）：171-177.

[25] 馮宏祖，劉映紅，何 林，等.阿維菌素和溫度脅迫對朱砂葉螨自由基及保護(hù)酶活性的影響[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2008，35（6）：530-536.

[26] 崔志新，林進(jìn)添，趙善歡.印楝素對中華稻蝗若蟲呼吸作用的影響[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，20（6）：544-546.

[27] 侯建虎，周小毛，柏連陽，等.茚蟲威對不同抗藥性品系小菜蛾呼吸代謝的影響[J].應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào)，2012，49（2）：471-476.

[28] FELTON G W，SUMMERS C B. Antioxidant systems in insects[J].Archives of Insect Biochemistry and Physiology，1995， 29：187-197.

[29] DUBOVSKIY I M，MARTEMYANOV V V，VORONTSOVA Y L，et al. Effect of bacterial infection on antioxidant activity and lipid peroxidation in the midgut of Galleria mellonella L. larvae （Lepidoptera：Pyralidae）[J].Comparative Iochemistry and Physiology，2008，148（1）：1-5.

[30] MORGAN E D. Azadirachtin， a scientific gold mine[J].Bioorganic and Medicinal Chemistry，2009，17：4096-4105.