杜 鵑，閆德俊，楊云云，陳 碩，魏 圓，沈 兵

(安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽 合肥 230032)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者死亡的重要原因[1-2]。腎血流動力學(xué)異常是DN早期的重要特點，表現(xiàn)為腎小球高壓、高灌注和高濾過，這些異常情況長期存在使腎小球系膜基質(zhì)及基底膜合成增加、降解減少，引起腎小球硬化，最終導(dǎo)致DN的發(fā)生[3]。腎小球系膜細(xì)胞(glomerular mesangial cells，GMCs)位于腎小球毛細(xì)血管袢內(nèi)，具有類似于血管平滑肌的多種功能，其收縮功能可通過改變毛細(xì)血管口徑，影響腎小球血流量和濾過面積，調(diào)節(jié)腎小球濾過率(glomerular filtration rate, GFR)[4]。已有報道，GMCs的功能失調(diào)與包括糖尿病慢性腎病在內(nèi)的多種腎臟疾病相關(guān)[5-6]。

鈣庫操縱的鈣內(nèi)流(store-operated Ca2+entry，SOCE)途徑參與引起GMCs的Ca2+內(nèi)流、產(chǎn)生收縮效應(yīng)[4,7]。Orai1和STIM1是SOCE的兩種主要通道蛋白。我們前期研究證實，STIM1和Orai1表達于GMCs，利用siRNA干擾降低STIM1或Orai1表達可明顯抑制原代培養(yǎng)的GMCs的SOCE水平[8]。Ca2+內(nèi)流，引起局部Ca2+濃度升高，可迅速激活下游信號分子——大電導(dǎo)鈣激活的鉀通道(large conductance calcium activated potassium channel, BKCa)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，BKCa也參與調(diào)節(jié)GFR[10]。但在GMCs中，SOCE與BKCa之間的相互關(guān)系以及高糖環(huán)境對其的影響并不清楚。本研究擬采用原代培養(yǎng)的大鼠GMCs作為研究對象，揭示GMCs中BKCa-Orai1之間是否存在物理性與功能性的相互作用，以及高糖培養(yǎng)模擬糖尿病對BKCa與Orai1在GMCs表達及其介導(dǎo)的功能的影響，從而為BKCa-Orai1相互作用在DN發(fā)病中的作用提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級♂SD大鼠，體質(zhì)量(150～180) g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物實驗嚴(yán)格遵照《實驗動物質(zhì)量管理方法》和《中華人民共和國實驗動物管理條例》法規(guī)，并經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)校動物倫理委員會同意。大鼠分籠飼養(yǎng)于室溫(20～24) ℃的環(huán)境中，自由攝食與飲水。

1.1.2試劑 毒胡蘿卜素(thapsigargin, TG)和Iberiotoxin(IbTX)購于Sigma公司；Fluo-8/AM、Pluronic F-127購于Invitrogen公司；ECL顯色試劑盒購于GE healthcare公司；Orai1抗體和BKCa抗體購于Santa Cruz Biotechnology公司；RPMI 1640、胎牛血清購于維森特生物技術(shù)有限公司；胰酶購于碧云天生物有限公司。

1.1.3儀器 鈣成像熒光顯微鏡(日本尼康公司)；4℃低溫離心機(美國Sigma公司)；低速離心機(湖南凱達科技儀器有限公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Bioshine Chemi Q 4600min化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海歐翔儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1GMCs原代培養(yǎng) 清潔級♂SD大鼠, 吸入過量CO2麻醉處死，消毒后打開腹腔，迅速取出兩側(cè)腎，移至超凈臺內(nèi)4℃ PBS中, 去除腎包膜, 將腎皮質(zhì)部分制成勻漿狀, 依次經(jīng)250、150、120 μm的不銹鋼篩網(wǎng)濾過，最后收集120 μm篩網(wǎng)上的顆粒組織，得到腎小球懸液。1 000 r·min-1離心5 min后取沉淀物，加入5 mL含有0.1% Ⅰ型膠原酶的PBS , 震蕩水浴箱內(nèi)37℃孵育30 min , 顯微鏡下顯示腎小球輕度破碎并松動，1 000 r·min-1離心5 min后取沉淀物，加入培養(yǎng)基懸浮，種植于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，1 h后更換新鮮培養(yǎng)基，去除雜質(zhì)，細(xì)胞培養(yǎng)液含有RPMI 1640、10%胎牛血清、100 mg·L-1青霉素和100 kU·L-1鏈霉素。

1.2.2Western blot法檢測蛋白表達水平 分別采用正常糖培養(yǎng)基(5 mmol·L-1D-glucose)和高糖培養(yǎng)基(25 mmol·L-1D-glucose)培養(yǎng)GMCs，3 d后移除培養(yǎng)基，加入蛋白裂解液，冰上放置40 min，4℃下12 000 r·min-1離心20 min，留取上清液。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)，用Bradford法對上清進行蛋白定量。取20 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE電泳，100 V轉(zhuǎn)移1 h至硝酸纖維素薄膜，放入封閉液中37℃封閉1 h；一抗 4℃過夜。β-tubulin作為蛋白加樣內(nèi)參。反復(fù)洗膜后，二抗孵育，室溫輕搖1 h，洗膜后，用 ECL試劑盒對目的條帶進行顯影、采集圖像，并用Quantity one軟件分析測定各帶吸光度(A)值作定量分析。

1.2.3免疫共沉淀(co-immunopricipitaiton, co-IP) 原代培養(yǎng)的GMCs加入細(xì)胞裂解液，置于冰上40 min，12 000 r·min-1、4℃離心20 min，留取上清液，分別加入3 μg一抗anti-BKCa或anti-Orai1抗體，4℃輕輕震蕩2 h，加入Protein agarose A 100 μL，混合后，4℃輕輕震蕩過夜。d 2，10 000 r·min-1、4℃離心2 min，棄上清，沉淀用細(xì)胞裂解液洗3次。加入100 μL細(xì)胞裂解液和50 μL三倍的上樣緩沖液。100℃加熱樣品，離心5 min，上清用于蛋白電泳檢測BKCa和Orai1的相互作用。

1.2.4細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度檢測 將消化后的GMCs接種于多聚賴氨酸包被后的玻片上，實驗前用Fluo-8/AM(終濃度為6 μmol·L-1，且含有0.02% Pluronic F-127)在37℃培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞30 min后，用無鈣PSS溶液(0 Ca2+-PSS：NaCl 140 mmol·L-1、MgCl21 mmol·L-1、KCl 5 mmol·L-1、EGTA 0.2 mmol·L-1、glucose 10 mmol·L-1、HEPES 4 mmol·L-1，pH 7.4)清洗玻片2遍后，將其安裝在鈣成像專用浴槽中，并向浴槽中加入500 μL 0 Ca2+-PSS，浴槽置于鈣成像熒光顯微鏡，實時記錄胞內(nèi)游離Ca2+熒光信號。實驗過程中，先在0 Ca2+-PSS加入TG(終濃度為 2 μmol·L-1)作用于細(xì)胞耗竭鈣庫，激活鈣庫操縱的鈣內(nèi)流通道，然后加入Ca2+(終濃度為1 mmol·L-1)引起Ca2+內(nèi)流，這一過程為SOCE，連續(xù)記錄20 min。熒光強度反映的是游離鈣離子的實時濃度，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化用熒光相對強度之比(F1/F0)表示。

1.2.5細(xì)胞膜電位記錄 如上細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度檢測實驗，GMCs用100 nmol·L-1DiBAC4(3)在室溫黑暗處孵育10 min，玻片清洗后安裝在專用浴槽中，并向浴槽中加入500 μL 0 Ca2+-PSS，浴槽置于鈣成像熒光顯微鏡，實時記錄DiBAC4(3)熒光信號。然后用2 μmol·L-1的TG在0 Ca2+-PSS溶液中處理10 min后，在細(xì)胞外液中加入Ca2+(使溶液Ca2+終濃度為2 mmol·L-1)，胞內(nèi)熒光濃度的變化按熒光相對強度之比(F1/F0)進行計算。

2 結(jié)果

2.1SOCE引起GMCs膜超極化為檢測SOCE對GMCs膜電位的影響，我們利用TG(2 μmol·L-1)耗竭GMCs內(nèi)鈣庫，激活鈣庫操縱的鈣通道，10 min后，外液中再加入Ca2+引起外鈣內(nèi)流。結(jié)果表明，SOCE可引起GMCs膜電位超極化，且BKCa的阻斷劑IbTX(50 nmol·L-1)可以明顯抑制SOCE引起的細(xì)胞膜超極化水平，說明SOCE引起的鈣內(nèi)流通過激活BKCa引起膜電位超極化(Fig 1)。

2.2Orai1與BKCa在GMCs上的物理性相互作用我們前期實驗已證實，Orai1參與介導(dǎo)GMCs的SOCE[8]。為驗證SOCE主要通道蛋白Orai1與BKCa在大鼠GMCs上的相互作用，我們將原代培養(yǎng)的大鼠GMCs裂解后，提取蛋白進行免疫共沉淀實驗。結(jié)果顯示，Orai1蛋白與BKCa蛋白之間可以相互沉淀(Fig 2)。結(jié)果提示，Orai1與BKCa可能在GMCs上形成了信號復(fù)合物，從而使SOCE介導(dǎo)的局部鈣濃度的變化可以更加精確、快速地調(diào)節(jié)細(xì)胞膜電位，進而通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)控制細(xì)胞內(nèi)的游離Ca2+濃度。

2.3高糖培養(yǎng)抑制SOCE引起的GMCs膜超極化水平為進一步揭示高糖對GMCs的SOCE及其引起的膜電位超極化的影響，我們?nèi)圆捎肨G(2 μmol

Fig 1 Role of BKCa in SOCE-induced membranehyperpolorization of rat GMCs

A: Representative traces showed after treated with 2 μmol·L-1thapsigargin (TG) for 10 min in 0 Ca2+-PSS, membrane hyperpolarization was evoked by 1 mmol·L-1extracellular Ca2+in GMCs with/without 50 nmol·L-1iberiotoxin(IbTX); B: Summary of data showed changes in membrane hyperpolarization in response to extracellular Ca2+(n=4～5).*P<0.05vscontrol.

Fig 2 Co-immunopricipitaion of Orai1 andBKCa in primary cultured rat GMCs (n=3)

Representative images showed coimmunoprecipitation followed by immunoblots. A: Immunoblot with anti-Orai1 antibody; B: Immunoblot with anti-BKCaantibody.

·L-1)耗竭鈣庫，激活鈣庫操縱的鈣通道，外液中再加入Ca2+引起外鈣內(nèi)流(Fig 1 A)。GMCs經(jīng)高糖培養(yǎng)3 d后，SOCE引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高增強(Fig 3)，而SOCE引起的細(xì)胞膜去極化絕對值也增大(Fig 4)。推測這一改變可能與SOCE的主要組成蛋白Orai1和BKCa通道蛋白表達水平的變化有關(guān)。

Fig 3 Effect of high glucose(HG) on store-operatedCa2+entry (SOCE) in GMCs

A: Representative SOCE traces was evoked by Ca2+response in GMCs with normal glucose(NG) and high glucose(HG) treatment for 3 days; B: Summary data showed effect of NG and HG in GMCs(n=4～5).*P<0.05vsNG treatment.

2.4高糖培養(yǎng)導(dǎo)致GMCs中Orai1與BKCa表達水平變化為揭示高糖引起的細(xì)胞Ca2+水平和膜電位變化的原因，我們進一步檢測了高糖培養(yǎng)對SOCE主要通道蛋白Orai1和下游信號分子BKCa的表達水平的影響。結(jié)果顯示，與正常糖培養(yǎng)相比較，原代培養(yǎng)的GMCs高糖處理3 d后，Orai1和BKCa的表達水平均明顯升高(Fig 5)。

3 討論

血管緊張素Ⅱ、血管升壓素、內(nèi)皮素-1等血管活性物質(zhì)都可通過SOCE途徑，引起GMCs的Ca2+內(nèi)流、產(chǎn)生收縮效應(yīng)[4,7]。SOCE通過細(xì)胞內(nèi)鈣庫的充盈與排空進行調(diào)控。當(dāng)胞內(nèi)鈣庫排空，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的STIM1蛋白N端的鈣感受器被激活，發(fā)生結(jié)構(gòu)改變并形成多聚體，位于胞質(zhì)的C端與細(xì)胞膜上的Orai1相互作用，激活Orai1通道，引起SOCE[11]。 我們前期研究證實，STIM1和Orai1表達于GMCs，并參與介導(dǎo)SOCE[8]。另外，研究發(fā)現(xiàn)，BKCa參與調(diào)節(jié)GFR[10]。在BKCaβ1亞單位敲除小鼠，基礎(chǔ)狀態(tài)下GFR是正常的，但在血容量增多時，卻無法像野生型小鼠一樣出現(xiàn)GFR相應(yīng)增加。從血流動力學(xué)方面分析，這種改變可能是因為表達于腎小球入球小動脈[12]和GMCs的BKCa功能異常所致[13]。然而研究表明，在腎小球入球小動脈，BKCa所發(fā)揮的抑制血管收縮的作用相對較弱[12]，而GMCs的BKCa在對抗其收縮中則發(fā)揮主要作用[13]。所以，當(dāng)敲除BKCaβ1亞基時，BKCa的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用減弱，引起持續(xù)的Ca2+內(nèi)流和GMCs收縮，腎小球濾過面積減小，導(dǎo)致GFR無法根據(jù)血容量的增加而增大。

Fig 4 Role of high glucose in SOCE-inducedmembrane hyperpolorization of rat GMCs

A: Representative traces showed after treatment with 2 μmol·L-1TG for 10 min in 0 Ca2+-PSS, membrane hyperpolarization was evoked by 1 mmol·L-1extracellular Ca2+in GMCs with NG or HG; B: Summary of data showed changes in membrane hyperpolarization in response to extracellular Ca2+(n=4～5). *P<0.05vsNG treatment.

Fig 5 Changes of Orai1 and BKCa protein expression induced byhigh glucose in rat primary cultured GMCs n=4)

*P<0.05vsNG treatment

本實驗結(jié)果顯示，在GMCs中，SOCE可以引起細(xì)胞超極化，這與Ca2+內(nèi)流引起膜的去極化的設(shè)想不同，說明SOCE激活了其他的通道參與這一過程。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，BKCa阻斷劑IbTX可以明顯抑制SOCE引起的細(xì)胞膜超極化水平。在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，為了快速、高效地激活下游分子，細(xì)胞中參與同一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的幾種分子可形成復(fù)合物。BKCa既然是SOCE介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流所激活的下游分子，那么是否可與SOCE通道蛋白形成信號復(fù)合物呢？我們利用co-IP檢測發(fā)現(xiàn)，BKCa可與Orai 1相互沉淀，提示BKCa與Orai 1形成了復(fù)合物。根據(jù)這些實驗結(jié)果，推測SOCE介導(dǎo)的鈣內(nèi)流可以通過引起局部Ca2+濃度升高，迅速激活下游信號分子BKCa通道，引起K+外流、細(xì)胞膜超極化，形成負(fù)反饋而抑制電壓依賴性鈣通道(voltage-dependence calcium channel, VDCC)，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流減弱，可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的收縮反應(yīng)[10]。

糖尿病患者早期腎臟病理改變可能與SOCE功能改變，引起的胞內(nèi)Ca2+信號異常有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，模擬糖尿病微環(huán)境的高糖處理可引起GMCs凋亡等改變[14]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，高糖處理增加SOCE水平和SOCE主要蛋白Orai1、STIM1的表達水平[15]。我們的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高糖培養(yǎng)3 d后，SOCE的主要通道蛋白Orai1的表達水平和介導(dǎo)的鈣內(nèi)流明顯加強，且SOCE引起的GMCs的膜超極化幅度明顯增大，繼續(xù)探究Orai1與BKCa通道蛋白表達水平發(fā)現(xiàn)，高糖培養(yǎng)GMCs 3 d增加Orai1與BKCa的表達水平。這些結(jié)果提示，高糖培養(yǎng)通過增加Orai1表達水平而使SOCE介導(dǎo)的鈣內(nèi)流增強，并更加高效地激活同樣高表達的下游信號分子BKCa通道，引起GMCs膜電位進一步超極化，從而抑制VDCC。這一機制可能參與了腎小球在糖尿病初期功能異常所引起的GFR的改變。但在糖尿病不同時期，GFR的變化有所不同，機制也不盡相同，關(guān)于鈣信號在糖尿病不同時期對系膜細(xì)胞與GFR的影響還有待進一步探討。

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