田巧珍，金 鑫，張 曼，張召議，王云鶴，楊銀鳳

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

隨著經(jīng)濟(jì)的轉(zhuǎn)型，畜牧業(yè)正向規(guī)?；?、集約化、高密度的養(yǎng)殖模式過渡。舍飼或半舍飼模式成為我國畜牧業(yè)的主要模式，由此導(dǎo)致畜禽疾病感染率增高。濫用抗生素引起的病原菌耐藥性增強(qiáng)、畜產(chǎn)品抗生素殘留超標(biāo)等問題愈發(fā)嚴(yán)重[1]，如何提高動(dòng)物機(jī)體自身免疫成為獸醫(yī)工作者的新課題。

防御素是一種廣泛存在于生物界中的陽離子抗菌肽，是宿主抵御外來物的基礎(chǔ)[2]。β-防御素廣泛存在于哺乳動(dòng)物和禽類體內(nèi)，在上皮細(xì)胞、白細(xì)胞、血漿、尿液及多種組織中均有表達(dá)[3-5]。在綿羊體內(nèi)，目前鑒定出2種β-防御素，被命名為綿羊β-防御素-1、-2(Sheep beta-defensin -1、-2，SBD-1、SBD-2)[6]。通過RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SBD-2 mRNA只表達(dá)于舌和遠(yuǎn)端回腸，SBD-1 mRNA卻在氣管和整個(gè)消化道(從舌～結(jié)腸)廣泛表達(dá)[7]。研究表明，綿羊防御素的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物主要在上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，且轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物含量最多的是瘤胃上皮組織[6]，由此可推斷，β-防御素是綿羊瘤胃上皮內(nèi)發(fā)揮天然免疫作用的重要成員。

動(dòng)物機(jī)體的益生菌群與黏膜免疫系統(tǒng)之間呈積極和諧的關(guān)系，益生菌在預(yù)防病原菌定植和維持腸道黏膜免疫中發(fā)揮著無可替代的作用[8]。益生菌黏附、定植于胃腸道上皮細(xì)胞是其發(fā)揮益生作用的基礎(chǔ)，因此上皮細(xì)胞是益生菌發(fā)揮益生作用的重要媒介[9]。益生性大腸桿菌 Nissle1917的鞭毛蛋白可以誘導(dǎo)人腸上皮細(xì)胞Caco-2表達(dá)β-防御素-2(hBD-2)[10]。乳酸菌和VSL#3菌能聯(lián)合增加腸道的免疫屏障功能，其作用機(jī)制主要涉及炎癥通路，包括NF-κB和AP-1及MAPK誘導(dǎo)上調(diào)hBD-2[11]。黎觀紅等[12]研究結(jié)果顯示，鼠李糖乳酸桿菌LGA能夠促進(jìn)雞小腸上皮細(xì)胞后抗菌肽β-防御素-9的表達(dá)。本試驗(yàn)室研究團(tuán)隊(duì)前期進(jìn)行了釀酒酵母等益生菌與防御素相關(guān)的研究[13-15]。盡管劉龍海等[16]研究了釀酒酵母菌發(fā)酵液的體外抑菌活性，但益生菌發(fā)揮益生作用的有效成分和機(jī)理目前還不是十分清楚。

釀酒酵母在釀酒、制藥、食品等行業(yè)中有著極高的應(yīng)用價(jià)值。酵母細(xì)胞壁位于酵母細(xì)胞最外層與生長(zhǎng)外環(huán)境直接接觸，它對(duì)維持酵母菌自身形態(tài)構(gòu)造、滲透壓、物質(zhì)代謝、免疫識(shí)別等至關(guān)重要[17]。迄今為止，關(guān)于釀酒酵母細(xì)胞壁與哺乳動(dòng)物特別是反芻動(dòng)物防御素表達(dá)的研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過采用釀酒酵母細(xì)胞壁刺激綿羊瘤胃上皮細(xì)胞，檢測(cè)不同濃度、不同時(shí)間酵母細(xì)胞壁作用綿羊瘤胃上皮細(xì)胞的SBD-1 mRNA和蛋白表達(dá)的變化，為從菌體表面抗原與上皮細(xì)胞抗菌肽表達(dá)關(guān)系的角度解析防御素發(fā)揮非特異性免疫的機(jī)制提供更多的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

釀酒酵母菌菌株購于中國微生物菌種網(wǎng)(編號(hào)：CGMCC 2.614)。瘤胃組織取自內(nèi)蒙古呼和浩特市北亞屠宰場(chǎng)。6月齡的健康蒙古綿羊屠宰后，立刻剪取約10 cm×10 cm大小的瘤胃組織，用無菌的含雙抗和兩性霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗凈后，帶回試驗(yàn)室備用。

1.2 主要儀器與試劑

儀器：CO2培養(yǎng)箱(Thermo)、顯微成像系統(tǒng)(Analytik Jena，German)、多功能酶標(biāo)儀(SynergyTMH4，Biotek)、超聲波細(xì)胞破碎儀(QSONICA Q700 Sonicator)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Q7，ABI)、激光共聚焦顯微鏡(ZEISS，German)。

試劑：DEME/F12培養(yǎng)基(GLIBCO)、FAST200總RNA極速抽提試劑盒(飛捷公司)、TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)、Glass beads(425～600 μm，Sigma)、TaKaRa熒光定量PCR酶(RR820A)、綿羊防御素β1(DEFβ1)ELISA試劑盒(ELA06599Sh)、Ms m Ab to Cytokeratin 18[c-04]、Goat anti-mouse IgG-FITC SC-2010(武漢新啟迪生物公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 釀酒酵母菌培養(yǎng)及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將活化的菌種接種于麥芽汁培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)48 h，用于發(fā)酵種子。將發(fā)酵液按5%的接種量接種到麥芽汁培養(yǎng)基中，相同條件培養(yǎng)48 h，每隔3 h取適量菌液測(cè)定OD600 nm值，繪制生長(zhǎng)曲線。將酵母培養(yǎng)液按5%的接種量接種到麥芽汁培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，在生長(zhǎng)剛進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)停止培養(yǎng)，離心收集菌體沉淀，用滅菌的PBS洗滌3次，冷凍干燥，-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 釀酒酵母細(xì)胞壁的提取及成分分析 采用玻璃珠和超聲波相結(jié)合的破碎方法，稱取10 g凍干酵母細(xì)胞，用滅菌PBS懸浮，在冰浴條件下，進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎(工作2 s/間歇2 s、30 min、功率70 W)，然后4 ℃、3 000 r·min-1離心10 min，去除上清液，反復(fù)超聲破碎2次；破壁完成后,用2% SDS緩沖液沸水浴10 min；室溫離心取沉淀,用PBS反復(fù)洗滌沉淀4～5次，直到離心上清透明為止，把沉淀冷凍干燥即為釀酒酵母菌全細(xì)胞壁成分，-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。采用凱氏定氮法測(cè)定細(xì)胞壁蛋白質(zhì)含量，酸水解法測(cè)定脂肪含量，HPLC測(cè)定葡聚糖含量，氣相色譜法測(cè)定甘露聚糖，X衍射檢測(cè)幾丁質(zhì)含量(送上海復(fù)昕檢測(cè)公司測(cè)樣)。

1.3.3 綿羊瘤胃上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 將瘤胃組織塊鈍性分離去除漿膜、肌層、黏膜下層,置于含1 000 U·mL-1青霉素、1 mg·mL-1鏈霉素、5 μg·mL-1兩性霉素的DPBS溶液中；在超凈工作臺(tái)，用含有抗生素的DPBS溶液反復(fù)洗滌浸泡30 min后，用含EDTA的0.25%胰蛋白酶進(jìn)行時(shí)間梯度消化并收集消化液中的細(xì)胞，離心、洗滌后，分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)原代細(xì)胞長(zhǎng)到80%以上時(shí)傳代，至第3代時(shí)，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用于后續(xù)的細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)。采用免疫熒光法鑒定綿羊瘤胃上皮細(xì)胞：將無菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)到50%時(shí)，取出蓋玻片，依次經(jīng)過4%多聚甲醛固定—0.25% Triton-100通透—5% BSA封閉后，4 ℃過夜，封閉一抗(CK18)，PBST漂洗，37 ℃避光孵育熒光二抗1 h，PBST漂洗，用DAPI復(fù)染4 min，PBST漂洗后，50%甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察照相。

1.4 釀酒酵母細(xì)胞壁成分對(duì)綿羊體外瘤胃上皮細(xì)胞的刺激試驗(yàn)

饑餓處理后的細(xì)胞，用DPBS洗滌后，加入釀酒酵母細(xì)胞壁不同濃度(0、25、50、100、200、400 μg·mL-1)的無血清無抗生素DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后，分別提取各組總RNA，以確定最佳誘導(dǎo)濃度；每孔加入200 μg·mL-1釀酒酵母細(xì)胞壁濃度的無血清無抗生素DMEM/F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)0、2、4、8、12、24 h后，分別提取各組總RNA，以確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

1.4.1 細(xì)胞總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用FAST200試劑盒，按其說明提取各試驗(yàn)組細(xì)胞總RNA，將提取的總RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)說明書進(jìn)行操作，得到的cDNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)SBD-1基因和管家基因β-actin序列用Oligo 6軟件設(shè)計(jì)特異性引物，送上海生工公司合成，引物序列見表1。以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，反應(yīng)完成后，根據(jù)擴(kuò)增曲線的Ct值計(jì)算SBD-1基因的相對(duì)表達(dá)量。本研究選用β-actin作內(nèi)參，根據(jù)公式2-ΔΔCt[18]求出不同濃度和時(shí)間釀酒酵母細(xì)胞壁對(duì)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞SBD-1基因的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 引物序列Table 1 The primer sequences for real time PCR

1.4.2 ELISA檢測(cè)共培養(yǎng)上清中SBD-1蛋白的表達(dá)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 收集各試驗(yàn)組瘤胃上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用綿羊防御素β1(SBD-1)ELISA試劑盒檢測(cè)SBD-1蛋白的表達(dá)，按其說明進(jìn)行操作。運(yùn)用Curve expert 1.4軟件以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD450 nm值作縱坐標(biāo)，用平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到二次多項(xiàng)式擬合方程(圖略)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示，以P<0.05和P<0.01分別表示差異顯著和極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 釀酒酵母菌的培養(yǎng)和細(xì)胞壁提取

2.1.1 釀酒酵母菌培養(yǎng)和生長(zhǎng)曲線的繪制 由圖1可見，釀酒酵母菌呈卵圓形具有典型的酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)[19](0.1%呂氏美藍(lán)染色)，在12 h時(shí)酵母菌生長(zhǎng)由對(duì)數(shù)期到達(dá)平臺(tái)期，故提取此時(shí)的酵母細(xì)胞壁作為刺激物。

A.釀酒酵母菌生長(zhǎng)曲線；B.平臺(tái)期釀酒酵母形態(tài)A.The proliferation curve of S.cerevisiae; B.The morphology of S.cerevisiae during logarithmic phase圖1 釀酒酵母菌培養(yǎng)結(jié)果Fig.1 The culture of S.cerevisiae

2.1.2 釀酒酵母細(xì)胞壁的鑒定 由圖2可知，細(xì)胞壁成分中甘露聚糖占的比重最大，其余依次為葡聚糖、蛋白質(zhì)、脂肪等，該釀酒酵母細(xì)胞壁的組成成分基本符合酵母細(xì)胞壁應(yīng)有的各個(gè)組分的比重[19-20]，說明本試驗(yàn)中所提取的細(xì)胞壁成分較純，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 釀酒酵母細(xì)胞壁成分組成Fig.2 Cell wall ingredients of S.cerevisiae

2.2 綿羊瘤胃上皮細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將原代細(xì)胞傳到第3代，可見貼壁細(xì)胞界限清晰，呈鵝卵石鋪路狀致密排列，符合試驗(yàn)要求(圖3A，3B)。用釀酒酵母細(xì)胞壁刺激后，綿羊瘤胃上皮細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量未發(fā)生明顯變化(圖3C，3D)。

2.2.2 細(xì)胞鑒定 用免疫熒光法檢測(cè)上皮細(xì)胞中骨架蛋白CK18的表達(dá)結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)CK18的表達(dá)呈明顯的陽性反應(yīng)，且分布于整個(gè)細(xì)胞胞漿，角蛋白染色陽性細(xì)胞占80%以上。

2.3 釀酒酵母細(xì)胞壁誘導(dǎo)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞表達(dá)SBD-1的研究

2.3.1 不同濃度釀酒酵母細(xì)胞壁對(duì)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞SBD-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響 如圖5所示，當(dāng)用不同濃度酵母細(xì)胞壁刺激綿羊瘤胃上皮細(xì)胞12 h后，200 μg·mL-1組SBD-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大，極顯著高于其它試驗(yàn)組(P<0.001，圖5A)；所以200 μg·mL-1用作試驗(yàn)的最佳濃度。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，SBD-1在蛋白水平的表達(dá)趨勢(shì)與在mRNA水平的表達(dá)趨勢(shì)基本一致。200 μg·mL-1濃度組酵母細(xì)胞壁刺激瘤胃上皮細(xì)胞后，SBD-1蛋白表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(P<0.001，圖5B)。

2.3.2 釀酒酵母細(xì)胞壁誘導(dǎo)不同時(shí)間對(duì)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞SBD-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響 用相同濃度的酵母細(xì)胞壁(200 μg·mL-1)分別刺激綿羊瘤胃上皮細(xì)胞0、2、4、8、12、24 h，在各組內(nèi)SBD-1 mRNA的表達(dá)量呈時(shí)間依賴關(guān)系，當(dāng)刺激12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大，并與對(duì)照組和其他時(shí)間組相比差異均極顯著(P<0.001，圖6A)。ELISA檢測(cè)結(jié)果如圖6B所示，SBD-1的蛋白表達(dá)趨勢(shì)與mRNA水平的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，12 h時(shí)酵母細(xì)胞壁刺激瘤胃上皮細(xì)胞表達(dá)SBD-1蛋白量極顯著高于對(duì)照組(P<0.001)。由此確定酵母細(xì)胞壁誘導(dǎo)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞表達(dá)SBD-1的最佳濃度為200 μg·mL-1，最佳時(shí)間為12 h。

圖4 瘤胃上皮細(xì)胞的免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果 (200×)Fig.4 The immunofluorescent detection of ruminal epithelial cells (200×)

A.RT-qPCR; B.ELISA。*.P<0.05;**. P<0.01;***. P<0.001。下同A.RT-qPCR; B.ELISA.*.P<0.05;**. P<0.01;***. P<0.001.The same as below圖5 不同濃度釀酒酵母細(xì)胞壁誘導(dǎo)瘤胃上皮細(xì)胞表達(dá)SBD-1和蛋白的結(jié)果(12 h)Fig.5 SBD-1 gene and protein expression of different concentrations of cell wall of S. cerevisiae stimulated ruminal epithelial cells (12 h)

圖6 釀酒酵母細(xì)胞壁誘導(dǎo)不同時(shí)間瘤胃上皮細(xì)胞表達(dá)SBD-1 mRNA和蛋白的結(jié)果(200 μg·mL-1)Fig.6 SBD-1 mRNA and protein expression of cell wall of S. cerevisiae stimulated ruminal epithelial cells at different times(200 μg·mL-1)

3 討 論

抗菌肽特別是防御素在人類和家畜體內(nèi)的天然免疫屏障中扮演著重要的角色，抗菌肽主要作用于病原微生物的細(xì)胞膜，且病原微生物不易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，可解決傳統(tǒng)抗生素藥物導(dǎo)致的抗藥性的難題[21-22]，但在家畜體內(nèi)進(jìn)行的抗菌肽的相關(guān)試驗(yàn)仍然滯后于人。利用人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，益生乳酸桿菌及其他益生菌可增加防御素的表達(dá)量從而提高機(jī)體天然免疫功能，但是利用癌細(xì)胞的結(jié)果來解釋正常細(xì)胞受限10，18]。此外，活體內(nèi)胃腸道pH環(huán)境、膽汁和各種消化酶等均對(duì)益生菌的活力和細(xì)胞壁組分的完整性產(chǎn)生影響。因此，本研究利用體外原代培養(yǎng)的正常綿羊瘤胃上皮細(xì)胞可以有效避免這些復(fù)雜因素的干擾及腸道共生菌相互之間的影響，為研究酵母提取物誘導(dǎo)SBD-1基因的表達(dá)提供了更客觀的資料。

酵母細(xì)胞壁是彈性很大的結(jié)構(gòu)，具有維持細(xì)胞形態(tài)、滲透性休克防護(hù)、防止機(jī)械應(yīng)力和細(xì)胞表面蛋白支架等功能，其生長(zhǎng)和形態(tài)均受到高度精密和極化方式的調(diào)節(jié)，這一過程主要受細(xì)胞壁的完整性控制信號(hào)通路的調(diào)控[23]。本研究利用玻璃珠結(jié)合超聲波的方法很容易將酵母細(xì)胞破碎，成功提取純度較高的酵母細(xì)胞壁，以用于后續(xù)研究。國外研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛飼養(yǎng)的日糧中添加酵母細(xì)胞壁可增強(qiáng)動(dòng)物抗病力，提高日增重等[24]。酵母細(xì)胞壁富含β-葡聚糖和甘露聚糖等多種活性物質(zhì)。酵母細(xì)胞壁的β-葡聚糖是非特異性免疫刺激多糖，能特異性結(jié)合機(jī)體的免疫細(xì)胞受體，刺激T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞產(chǎn)生大量的巨噬細(xì)胞，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[25]。β-葡聚糖是一種重要的消化道黏膜免疫增強(qiáng)劑[26]，飼喂β-葡聚糖可提高荷斯坦?fàn)倥８晌镔|(zhì)的采食量[27]。腸道病原菌的鞭毛或絨毛上的外源凝集素特異性識(shí)別宿主上皮細(xì)胞膜的受體并與之結(jié)合進(jìn)而發(fā)生感染，而甘露聚糖可有效的干擾腸道病原體的定植。同時(shí)甘露糖可為腸道內(nèi)有益菌(如雙歧桿菌、乳酸桿菌等)提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)有益菌大量繁殖，進(jìn)一步抑制有害菌生長(zhǎng)[28]。戈婷婷等[29]發(fā)現(xiàn)，甘露寡糖提高了錦江黃牛瘤胃培養(yǎng)液揮發(fā)性脂肪酸和菌體蛋白濃度。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母細(xì)胞壁誘導(dǎo)體外綿羊瘤胃上皮細(xì)胞SBD-1的表達(dá)結(jié)果呈劑量—時(shí)間依賴關(guān)系，釀酒酵母細(xì)胞壁刺激綿羊瘤胃上皮細(xì)胞不同時(shí)間后，在12 h時(shí)，SBD-1基因表達(dá)量達(dá)到最大，這種依賴趨勢(shì)與黎觀紅的試驗(yàn)結(jié)果吻合[12]。本研究采用RT-qPCR和ELISA方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SBD-1的mRNA與蛋白的表達(dá)趨勢(shì)一致，且釀酒酵母細(xì)胞壁刺激后的瘤胃上皮細(xì)胞SBD-1基因表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，說明SBD-1在轉(zhuǎn)錄水平開始就調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)。

綜合本試驗(yàn)結(jié)果推斷，酵母細(xì)胞壁可誘導(dǎo)或促進(jìn)上皮細(xì)胞防御素的表達(dá)，對(duì)黏膜形成保護(hù)，抑制和殺滅有害菌并調(diào)節(jié)有益菌數(shù)量和種類以維持胃腸道微生態(tài)平衡。酵母細(xì)胞壁作為廉價(jià)的抗生素的天然替代品，可作為飼料補(bǔ)充劑來提高家畜的免疫水平，為解決傳統(tǒng)抗生素藥物導(dǎo)致的抗藥性難題提供新思路，研究如何提高家畜體內(nèi)抗菌肽表達(dá)至合理的水平，從而去預(yù)防和治療家畜疾病提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平得出了釀酒酵母細(xì)胞壁能有效促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞SBD-1的表達(dá)，且釀酒酵母細(xì)胞壁以200 μg·mL-1濃度在刺激瘤胃上皮細(xì)胞12 h，SBD-1基因的表達(dá)量達(dá)到最高，釀酒酵母細(xì)胞壁刺激瘤胃上皮細(xì)胞后SBD-1蛋白可分泌到細(xì)胞外發(fā)揮其生物學(xué)功能。

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