吳 娟， 張立夏， 袁 燕， 何順晨， 班峻峰， 梁燕玲， 董艷芬， 呂竹芬

(1.廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006； 2.廣東藥科大學(xué)藥物研究所，廣東廣州 510006；3.廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院，廣東廣州 510006)

烏欖別稱黑橄欖、木威子，為橄欖科橄欖屬植物，分布于我國(guó)南部的福建、兩廣、云南等地，其果實(shí)具有止血、利水、解毒之功效，民間常用于治療風(fēng)濕性腰腿痛、手足麻木、感冒、上呼吸道炎、肺炎、乳癰等[1-2]。現(xiàn)代藥理研究表明，烏欖果具有降壓、減慢心率，舒張血管等作用[3-4]。而本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，烏欖果也具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，簡(jiǎn)稱AS)的作用。

AS是具有慢性炎癥反應(yīng)特征的病理過程，其發(fā)展始終伴隨炎癥反應(yīng)[5]。氧化應(yīng)激(oxidative stress，簡(jiǎn)稱OS)是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡而傾向于氧化作用，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物。而氧化應(yīng)激在動(dòng)脈粥樣過程中扮演重要角色，活性氧簇(reactive oxygen species，簡(jiǎn)稱ROS)產(chǎn)生的活性氧可能在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)作為一個(gè)特殊調(diào)節(jié)器去中轉(zhuǎn)在細(xì)胞膜向細(xì)胞核調(diào)節(jié)信號(hào)中環(huán)境的或者物理的信號(hào)產(chǎn)生，致使炎癥基因表達(dá)的調(diào)節(jié)[6-7]。所以抗氧化劑在一定程度上能抑制炎癥和AS的發(fā)生發(fā)展。而與合成抗氧化劑相比，天然抗氧化劑具有低毒、價(jià)廉、易得等優(yōu)點(diǎn)，這也使越來越多的藥學(xué)家從天然植物中尋找具有抗氧化活性的物質(zhì)。

黃酮類化合物是一種存在于植物中的天然產(chǎn)物，屬于天然抗氧化劑，具有降脂、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤等活性[8-11]。已有研究表明，烏欖果具有較好的抗氧化活性[12]，但有關(guān)對(duì)烏欖果中抗氧化部位及成分的研究未見報(bào)道。采用響應(yīng)面法對(duì)烏欖果中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并考察烏欖果總黃酮提取物的體外抗氧化活性，旨在為烏欖的進(jìn)一步開發(fā)利用和烏欖果總黃酮的生物活性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)100080-201409，純度91.9%，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供)；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，簡(jiǎn)稱DPPH；上海麥克林生化科技有限公司)、2，2′-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)[2，2′-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，簡(jiǎn)稱ABTS；上海阿拉丁生化科技股份有限公司]、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(butylated hydroxytoluene，簡(jiǎn)稱BHT；上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、維生素C(純度≥97%，廣州化學(xué)試劑廠)；其他所用試劑均為分析純。

于2015年8月中旬在廣東省中山市大涌鎮(zhèn)采摘烏欖果藥材，由廣東藥科大學(xué)中藥標(biāo)本館劉基柱教授鑒定為橄欖科橄欖屬烏欖的干燥果實(shí)。

1.2 儀器與設(shè)備

主要儀器有UV-2700紫外-可見分光光度計(jì)[島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司]、BS224S型電子天平、CP225D型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]、Julabo TW-20水浴鍋[優(yōu)萊博技術(shù)(北京)有限公司]、KQ-300DA超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、TC-15恒溫電熱套(海寧市華星儀器廠)、RE52-05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、循環(huán)水式真空泵、LXJ-IIB型低速大容量多管離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、GZX-9246MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 烏欖果總黃酮的提取 烏欖鮮果洗凈，曬干，粉碎后過10目篩得到烏欖果粉末，置于4 ℃條件下存放備用。準(zhǔn)確稱取20 g烏欖果粉末，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，回流提取一定時(shí)間，過濾，離心除去藥渣，取上清液，作為烏欖果總黃酮提取液(相當(dāng)于生藥濃度為0.05 g/mL，下同)。提取液濃縮至無醇味時(shí)，過濾，取沉淀，得到烏欖果總黃酮提取物(記為GC)，備用(測(cè)體外抗氧化活性)。

1.3.2 總黃酮含量測(cè)定方法的建立 取1 mL烏欖果總黃酮提取液，用60%乙醇稀釋100倍，搖勻，作為供試品溶液。

1.3.2.1 線性關(guān)系考察 總黃酮含量測(cè)定方法按照Ibrahim等所述[13]，稍加修改。精確吸取0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 質(zhì)量濃度為1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液于10 mL容量瓶中，分別加0.4 mL 5%亞硝酸鈉，搖勻，靜置6 min，加入 0.4 mL 10%硝酸鋁，搖勻，靜置6 min。加4 mL 5%氫氧化鈉，用60%乙醇稀釋定容，搖勻，靜置15 min。以60%乙醇為空白對(duì)照，在510 nm處測(cè)定吸光度。以所測(cè)吸光度(y)對(duì)溶液濃度(x)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程y=11.723 3x+0.018 798 8(r2=0.999 3)，說明蘆丁在0～500 μg/mL線性良好。

1.3.2.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精確量取6份1 mL供試品溶液，按“1.3.2.1”節(jié)下方法測(cè)定吸光度D510 nm，所測(cè)供試品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，簡(jiǎn)稱RSD)為1.29%，小于2.00%，說明該方法重復(fù)性良好。

1.3.2.3 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 精確量取1 mL供試品溶液，按“1.3.2.1”節(jié)下的方法分別于1、2、3、4、5 h測(cè)定吸光度D510 nm，結(jié)果表明該方法在5 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.3.2.4 回收率試驗(yàn) 向供試品溶液中加入一定量的蘆丁對(duì)照品溶液，按“1.3.2.1”節(jié)下方法測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算回收率為102.47%(RSD=2.075%，n=6)，說明回收率良好。

1.3.2.5 烏欖果總黃酮提取率的計(jì)算

總黃酮提取率=烏欖果中總黃酮質(zhì)量/烏欖果藥材質(zhì)量×100%。

1.3.3 單因素試驗(yàn) 在前期的試驗(yàn)過程中，比較回流提取法、超聲法和80 ℃溫浸法對(duì)烏欖果黃酮類成分提取效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，回流提取效果最佳(圖1)。因此，選擇回流法作為工藝優(yōu)化的提取方法，以烏欖果總黃酮提取率為指標(biāo)，對(duì)提取工藝中的提取次數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和料液比等因素進(jìn)行單因素考察，為黃酮的最佳提取工藝優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支持。

1.3.3.1 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響 稱取20 g烏欖果粉末，平行5份，分別以料液比(g ∶mL)為1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40的比例加入50%乙醇，回流提取1 h，按“1.3.2.1”節(jié)下方法測(cè)定總黃酮含量。

1.3.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響 稱取20 g烏欖果粉末，平行5份，加入400 mL不同體積分?jǐn)?shù)(10%、30%、50%、70%、90%)的乙醇溶液，回流提取1 h。按“1.3.2.1”節(jié)下方法測(cè)定總黃酮含量。

1.3.3.3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響 稱取20 g烏欖果粉末，平行4份，加入400 mL 50%乙醇，分別回流提取1、2、3、4 h，按“1.3.2.1”節(jié)下方法測(cè)定總黃酮提取率。

1.3.3.4 提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響 稱取20 g烏欖果粉末，平行3份，加入400 mL 50%乙醇，分別提取1、2、3次，每次1 h，過濾，合并提取液，按“1.3.2.1”節(jié)下方法測(cè)定總黃酮含量。

1.3.4 Box-Behnken響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以烏欖果總黃酮提取率為響應(yīng)值，選取提取乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取時(shí)間(B)、液料比(C)3因素3水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，試驗(yàn)方案與結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1.3.5 烏欖果總黃酮體外抗氧化活性研究

1.3.5.1 DPPH·清除率 參考Santos等的方法[14]，并加以修改。在10 mL具塞刻度試管中，精確加入2.0 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液及2 mL不同質(zhì)量濃度(0.001、0.005、0.010、0.050、0.100 mg/mL，以烏欖果總黃酮提取物質(zhì)量計(jì)，溶劑為乙醇溶液，下同)的GC溶液，充分混合，室溫避光反應(yīng)30 min，517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度D517 nm，記為Dsample；以等體積無水乙醇代替提取液，同法操作所得D517 nm記為Dcontrol；以等體積無水乙醇代替DPPH乙醇溶液，加入不同質(zhì)量濃度的提取液，同法操作所得D517 nm記為Dblank；以維生素C及BHT為陽性對(duì)照，平行測(cè)定3次，取平均值。采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，計(jì)算IC50。

1.3.5.2 ABTS·清除率的測(cè)定 ABTS·清除率的測(cè)定參考Re等的方法[15]，并稍加修改。取40 μL質(zhì)量濃度為0.10、0.20、0.40、0.60、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1.00 mg/mL的GC溶液，加入4 mL 7 mmol/L的ABTS測(cè)定液，振搖30 s，反應(yīng)10 min后，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)得D734 nm，平行測(cè)定3次，取平均值。同時(shí)，以維生素C為陽性對(duì)照(質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.20、0.23、0.26、0.30 mg/mL)，同法測(cè)定。

1.3.5.3 總還原力測(cè)定 總還原能力測(cè)定參考Luqman等的方法[16]。在700 nm波長(zhǎng)下測(cè)定D700 nm，待測(cè)樣品的D700 nm越大，其還原力越強(qiáng)，抗氧化活性就越強(qiáng)。準(zhǔn)確移取20、40、60、80、100、120 μL質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的GC溶液，加蒸餾水至0.5 mL，依次加入1.0 mL pH值為6.6的磷酸鹽緩沖溶液、2.0 mL 1%鐵氰化鉀，于50 ℃條件下水浴20 min，急速冷卻，加入1.0 mL 10%三氯乙酸、0.5 mL 0.1%三氯化鐵，搖勻，室溫下靜置10 min；以維生素C為陽性對(duì)照(準(zhǔn)確移取20、40、60、80、100、120 μL質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的維生素C溶液)，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度D700 nm，平行測(cè)定3次，取平均值。

表2 試驗(yàn)方案與結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖2-A可知，隨著料液比的增加，總黃酮提取率隨之增加，當(dāng)料液比為1 g ∶40 mL時(shí)，總黃酮提取率為13.05%，考慮到實(shí)際生產(chǎn)，選取料液比為1 g ∶20 mL～1 g ∶40 mL進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖2-B可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在10%～50%范圍內(nèi)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮提取率明顯增加；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最大值；此后黃酮提取率呈下降趨勢(shì)。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)50%～70%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖2-C可知，提取時(shí)間在1～3 h時(shí)，總黃酮提取率隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增加；提取時(shí)間為3 h時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大；提取時(shí)間到4 h時(shí)，黃酮提取率反而降低，這可能是由于時(shí)間的增加使部分黃酮被氧化而導(dǎo)致含量降低。因此，選擇提取時(shí)間2～4 h進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.4 提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖2-D可知，隨著提取次數(shù)的增加，總黃酮提取率增加不明顯?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)，選取1次提取。

2.5 Box-Behnken響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果

利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到總黃酮提取率的數(shù)學(xué)回歸模型為：總黃酮提取率(%)=10.61-1.66A+0.44B+0.99C-0.49AB+0.46AC+0.31BC-0.50A2-0.67B2-0.016C2，對(duì)此模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示；繪制響應(yīng)面和等高線，如圖3所示。

表3 回歸模型的方差結(jié)果分析

由表3可知，回歸模型的P<0.000 1，表明該回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)P>0.05，不顯著，說明該模型成立。模型的相關(guān)系數(shù)r2=0.981 4，校正相關(guān)系數(shù)r2=0.957 5，r2和校正r2均較高且接近，說明模型準(zhǔn)確性和通用性較高；變異系數(shù)值為3.06%<10.00%，說明試驗(yàn)的可信度與精確度高，擬合程度較好，試驗(yàn)操作可行，可以用此模型來預(yù)測(cè)烏欖果總黃酮最佳提取工藝條件。該回歸模型中的一次項(xiàng)A、B、C，交互項(xiàng)AB、AC、BC，二次項(xiàng)A2、B2對(duì)總黃酮提取的綜合評(píng)分影響顯著。各因素對(duì)烏欖果總黃酮提取率的影響大小順序依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)>料液比(C)>提取時(shí)間(B)。由圖3可知，A與C的曲面變化幅度較大，說明料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綜合評(píng)分結(jié)果交互作用明顯。

通過軟件對(duì)二次多項(xiàng)式回歸方程進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，乙醇回流提取烏欖果總黃酮的最佳提取工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，提取時(shí)間為4 h，料液比為1 g ∶40 mL，此時(shí)能夠得到的總黃酮提取率最高，為15.278 2%。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果表明，烏欖果總黃酮提取率為(15.060±0.035)%，與理論值相比誤差僅為0.218 2，驗(yàn)證了該模型是可行有效的。

2.6 烏欖果總黃酮體外抗氧化活性研究

2.6.1 DPPH·清除率 由圖4-A可知，在試驗(yàn)質(zhì)量濃度(0.5、2.5、5.0、25.0、50.0 μg/mL)范圍內(nèi)，烏欖果總黃酮提取物、維生素C及BHT均具有清除DPPH自由基的作用，同等濃度下清除DPPH自由基的能力由高到低依次為維生素C>BHT>GC，其IC50分別為(2.08±0.10)、(10.15±0.51)、(18.18±0.71) μg/mL，且清除率隨著質(zhì)量濃度的增大而升高，呈明顯的劑量依賴關(guān)系。

2.6.2 ABTS·清除率 當(dāng)GC質(zhì)量濃度為0.99、1.98、3.96、5.94、7.43、7.92、8.42、8.91、9.41、9.90 μg/mL，維生素C質(zhì)量濃度分別為0.50、0.99、1.98、2.28、2.57、2.97 μg/mL時(shí)，對(duì)ABTS·的清除率進(jìn)行測(cè)定。由圖4-B可知，維生素C及GC均具有較高清除ABTS·的作用，其IC50分別為(1.71±0.02)、(3.88±0.10) μg/mL，且清除率隨著質(zhì)量濃度的增大而升高，呈明顯的劑量依賴關(guān)系。

2.6.3 總還原力測(cè)定 當(dāng)GC質(zhì)量濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 μg/mL，維生素C的質(zhì)量濃度為0.8、1.6、2.4、3.2、4.0、4.8 μg/mL時(shí)，對(duì)總還原力進(jìn)行測(cè)定。由圖 4-C 可知，在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著烏欖總黃酮和維生素C的質(zhì)量濃度增大D700 nm明顯增加，說明二者均具有良好的還原能力，在相同質(zhì)量濃度下，維生素C的總還原力大于烏欖果總黃酮。

3 結(jié)論與討論

采用響應(yīng)面法對(duì)烏欖果總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，最佳提取工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、料液比1 g ∶40 mL、提取時(shí)間為4 h；3次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果為(15.060±0.035)%，與模型預(yù)測(cè)值15.278 2%接近，說明采用Box-Behnken方法優(yōu)化提取總黃酮工藝行之有效，為以后烏欖果總黃酮的產(chǎn)業(yè)化提供指導(dǎo)。

從DPPH·清除率、ABTS·清除率及總還原力3個(gè)方面對(duì)烏欖果總黃酮的體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明， 烏欖果總黃酮對(duì)DPPH·、ABTS·均具有較強(qiáng)的清除能力，其半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為(18.18±0.71)、(3.88±0.10) μg/mL[維生素C的IC50分別為(2.08±0.10)、(1.71±0.02) μg/mL]，有較強(qiáng)的還原能力，說明烏欖果總黃酮具有較好的體外抗氧化活性。

AS與炎癥的關(guān)系相當(dāng)復(fù)雜，在AS病變的發(fā)生發(fā)展過程中，從脂質(zhì)條紋到纖維斑塊和粥樣斑塊乃至不穩(wěn)定斑塊的生成、破裂和血栓形成，始終都有各種炎癥細(xì)胞和大量炎癥介質(zhì)參與。烏欖果總黃酮的抗氧化活性能從減少氧化應(yīng)激的角度，在一定程度上抑制AS及炎癥病變的發(fā)生發(fā)展，但對(duì)于其體內(nèi)抗氧化活性及其抗炎、抑制AS作用的機(jī)制還未知，而這也是本課題組下一步須要探討的。

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