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        奶牛隱性乳房炎金黃色葡萄球菌分離鑒定及藥敏試驗

        2018-06-07 02:47:36蔣成硯鄭秋燕周文樹唐秀華
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年10期

        謝 昆, 蔣成硯, 鄭秋燕, 周文樹, 唐秀華, 汪 鏡

        (紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南蒙自 661100)

        奶牛乳房炎是奶牛最常見的疾病之一,它一直是困擾奶牛業(yè)經(jīng)濟效益及迅速發(fā)展的重要原因之一,隱性乳房炎是乳房炎的一種,流行面廣,為臨床型乳房炎的15~40倍,引起奶產(chǎn)量降低4%~10%,影響牛奶質(zhì)量,并易轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床型乳房炎,造成更為嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[1]。引起隱性乳房炎的因素有多種,如物理、化學(xué)、機械、微生物感染等,其中葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原物之一,據(jù)報道約有1/2以上的乳房炎都是由該細(xì)菌引起的,對奶牛乳腺組織造成損傷,使產(chǎn)奶量降低,奶牛的使用年限大大縮短,牛奶的品質(zhì)和營養(yǎng)價值受到影響,還制約著乳品加工業(yè)的健康發(fā)展,給乳制品工業(yè)帶來巨大損失[2]。

        近年來,隨著我國牛奶業(yè)的發(fā)展,在葡萄球菌方面關(guān)注度越來越高,對于葡萄球菌的研究也越來越深入,基本鑒定方法有4種,包括血漿凝固酶法、DNA分解酶法、甘露醇發(fā)酵試驗、溶血現(xiàn)象。其中金黃色葡萄球菌不僅影響奶牛的泌乳量而且嚴(yán)重影響乳汁的衛(wèi)生質(zhì)量,它與鏈球菌、大腸桿菌所引起的乳房炎約占奶牛乳房炎的90%以上[3-4]。

        本研究從新鮮牛奶中分離引起隱性乳房炎的金黃色葡萄球菌,通過細(xì)菌的培養(yǎng)、染色鑒定、生理生化試驗,對病原菌進(jìn)行鑒定,鑒定后進(jìn)行藥敏試驗,以期獲得敏感性的抗生素,為隱性乳房炎的治療提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        試驗材料為新鮮牛奶,采自蒙自養(yǎng)殖戶,無菌采集后帶回試驗室在4 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2 培養(yǎng)基

        牛肉膏蛋白胨普通培養(yǎng)基,血皿普通培養(yǎng)基,麥康卡培養(yǎng)基,甲基紅培養(yǎng)基,亞硝酸還原培養(yǎng)基,糖類發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(發(fā)酵管)。

        1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)及純化

        將樣品按10倍梯度稀釋后,接種在普通瓊脂培養(yǎng)基和血皿培養(yǎng)基上,在37 ℃條件下無氧培養(yǎng)24 h,待菌落長出后,經(jīng)過2種培養(yǎng)基上菌落的對比,在血皿培養(yǎng)基上挑出有溶血圈的可疑菌落,將可疑菌落繼續(xù)接種在以上2種培養(yǎng)基上,并同時接種在麥康卡培養(yǎng)基上,而在前2種培養(yǎng)基中細(xì)菌均能正常生長,在最后一種培養(yǎng)基上則不生長,將這種菌株反復(fù)在普通培養(yǎng)基上培養(yǎng),劃線分離,直至菌落較純化。待菌株生長良好后,仔細(xì)觀察菌落形態(tài)。

        1.4 細(xì)菌形態(tài)鑒定

        分離的細(xì)菌首先進(jìn)行革蘭氏染色,后再在顯微鏡下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)。

        1.5 生理生化鑒定

        將分離得到的革蘭氏染色為陽性的細(xì)菌做過氧化氫酶試驗,凡是革蘭氏染色為陽性、過氧化氫酶產(chǎn)生氣泡的細(xì)菌均暫定為葡萄球菌屬,再進(jìn)一步做甲基紅試驗、各種發(fā)酵糖試驗、硝酸還原試驗、血凝固酶試驗。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》來確定所屬的種。

        1.6 PCR鑒定

        采用CTAB法提取經(jīng)過生理生化鑒定的細(xì)菌DNA,根據(jù)GenBank上發(fā)表的金黃色葡萄球菌16S rRNA序列(NR_075000),設(shè)計1對特異性引物如下,預(yù)計擴增產(chǎn)物大小為 1 521 bp。

        P1:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,

        P2:5′-TCCGATACGGCTACCTTGTTACG-3′。

        以細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴增,反應(yīng)條件如下:94 ℃的預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,35個循環(huán),72 ℃ 延伸10 min,反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴增產(chǎn)物電泳檢測。將檢測正確的PCR產(chǎn)物送交生工生物(上海)股份有限公司測序。將測序結(jié)果與GenBank上發(fā)表的金黃色葡萄球菌16S rRNA序列進(jìn)行同源性比較。

        1.7 藥敏試驗

        將經(jīng)生理生化鑒定后的細(xì)菌涂布在培養(yǎng)皿上,并把各種藥敏片標(biāo)記后放在該培養(yǎng)皿中,待培養(yǎng)24 h之后觀察結(jié)果。觀察抑菌圈的大小,用抑菌圈大小判定各種藥敏片對細(xì)菌的敏感程度。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 病原菌的形態(tài)特征

        在血皿培養(yǎng)基上,菌落周圍有溶血現(xiàn)象,出現(xiàn)溶血圈,菌落為圓形,平板形成濕潤、表面光滑、邊緣有些不整齊,呈白色或金黃色,中央有凸起的菌落(圖1)。葡萄球菌的菌體都是圓形的,一般在顯微鏡下觀察是呈葡萄串狀,革蘭氏染色呈陽性(圖2)。

        所分離的葡萄球菌的形態(tài)特征,菌落直徑在0.5~1.5 mm 之間,凸起、圓形、光滑、金黃色,偶爾也為白色;細(xì)菌為圓形,通常是以葡萄串狀存在,偶爾有單個,缺乏鞭毛。

        2.2 病原菌的生理生化鑒定

        本試驗對牛奶中分離得到的葡萄球菌進(jìn)行生理生化鑒定,由表1可知,革蘭氏染色試驗、過氧化氫酶試驗、血凝固酶試驗、甲基紅試驗、硝酸還原試驗等均為陽性,根據(jù)形態(tài)特征和常規(guī)的生理生化鑒定結(jié)果,試驗分離出的細(xì)菌確定為葡萄球菌屬。

        表1 分離細(xì)菌的生理生化試驗結(jié)果

        注:+為陽性反應(yīng),-為陰性反應(yīng)。

        2.3 病原菌發(fā)酵特性分析

        將分離到的葡萄球菌屬的菌株,做進(jìn)一步的發(fā)酵試驗,試驗結(jié)果見表2,參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行種的鑒定。

        由表2可知,所分離出來的葡萄球菌是金黃色葡萄球菌。

        表2 分離株的糖發(fā)酵試驗結(jié)果

        注:+為陽性反應(yīng),-為陰性反應(yīng)。

        2.4 病原菌的PCR鑒定

        經(jīng)生理生化鑒定的病原菌,設(shè)計1對金黃色葡萄球菌16S rRNA特異性引物,以病原菌DNA為模板,進(jìn)行PCR擴增,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。由圖3可知,PCR產(chǎn)物大小1 521 bp,與預(yù)期大小一致。由圖4可知,PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后發(fā)現(xiàn)與GenBank登錄的金黃色葡萄球菌16S rRNA(NR_075000)有2個核苷酸的差異,證明分離的病原菌為金黃色葡萄球菌。

        2.5 病原菌藥敏試驗結(jié)果

        參照美國臨床試驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會1994年制定的抗生素敏感度判斷標(biāo)準(zhǔn)(NCCLS1994)判斷抑菌結(jié)果。抑菌圈直徑>15 mm 為高敏感度抑菌作用,用“+++”表示;10 mm<抑菌圈直徑<15 mm為中敏感度抑菌作用,用“++”表示;抑菌圈直徑<10 mm為低敏感度抑菌作用,用“+”表示;抑菌圈直徑<5 mm的為無抑菌作用,用“-”表示。

        由表3可知,分離得到的葡萄球菌對萬古霉素和頭孢噻吩敏感度高,對慶大霉素、四環(huán)素、青霉素為中度敏感,對于四環(huán)素和諾氟沙星敏感度低,而對于環(huán)丙沙星不敏感。

        3 討論

        3.1 分離培養(yǎng)基的選擇

        從不同的基質(zhì)中分離葡萄球菌時,據(jù)葡萄球菌的生長環(huán)境條件以及它在不同培養(yǎng)基上生長的情況進(jìn)行培養(yǎng)基的組分選擇[5]。對于葡萄球菌的分離,多數(shù)人選擇有色培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)。本試驗所用的培養(yǎng)基是普通培養(yǎng)基(培養(yǎng)細(xì)菌),而一些常見的病原菌也可以在普通培養(yǎng)基上生長,如鏈球菌、大腸桿菌等在普通培養(yǎng)基上生長,但鏈球菌生長差,有時不生長。大腸桿菌雖然生長旺盛,但是它的菌落大小和形態(tài)與葡萄球菌是完全不同的,因此降低了分離的難度。

        3.2 細(xì)菌的分離鑒定

        細(xì)菌的分離鑒定方法很多,可以是常規(guī)的生化鑒定,也可以是分子生物學(xué)鑒定,包括DNA測定、PCR技術(shù)、血清鑒定等。得益于現(xiàn)在技術(shù)的發(fā)達(dá),較多的人是采用分子鑒定方法,利用分子鑒定能更快速地鑒定出結(jié)果[6]。本試驗是用的常規(guī)生化鑒定方法結(jié)合分子生物學(xué)方法,能快速準(zhǔn)確鑒定出分離的病原菌。

        表3 藥敏試驗抑菌圈的平均直徑

        注:直徑長度用mm表示。

        3.3 分離菌的耐藥性

        根據(jù)所查的資料,劉軍等是用菌株數(shù)來表示該菌對各種藥敏片的耐藥性,他們試驗的結(jié)果是青霉素、四環(huán)素的耐藥性較差,本研究是用抑菌圈表示各種藥片對該菌的敏感程度,根據(jù)抑菌圈的大小判斷可知,青霉素和四環(huán)素的抑菌圈較小,表示耐藥性較強;諾氟沙星和環(huán)丙沙星的抑菌圈最小,耐藥性最差,由此可見該細(xì)菌對于這幾種藥已經(jīng)產(chǎn)生了抗性[7-8]。為了在今后的治療中不讓菌株產(chǎn)生抗藥性,應(yīng)擴大抗生素應(yīng)用的廣譜性,抗生素之間試行交叉使用。本研究結(jié)果說明在不同地區(qū)葡萄球菌對各種抗生素的抗性不同,耐藥性也是有差別的,研究結(jié)果可以為當(dāng)?shù)仡A(yù)防奶牛乳房炎的發(fā)生與流行奠定基礎(chǔ)[9-10]。

        本試驗采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定方法,再根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》鑒定出從牛奶中分離出來的葡萄球菌,并根據(jù)各種生理生化試驗鑒定出它是致病性金黃色葡萄球菌。根據(jù)本試驗藥敏片產(chǎn)生的抑菌圈大小可知,萬古霉素和頭孢噻吩的抑菌圈最大,平均在15 mm以上,對細(xì)菌的敏感度高;慶大霉素、紅霉素和青霉素的抑菌圈在10~15 mm之間,敏感度中;四環(huán)素和諾氟沙星的抑菌圈在5~10 mm 之間,敏感度低;環(huán)丙沙星的抑菌圈在5 mm以下,對細(xì)菌不敏感。

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