謝 昆， 蔣成硯， 鄭秋燕， 周文樹， 唐秀華， 汪 鏡

(紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南蒙自 661100)

奶牛乳房炎是奶牛最常見的疾病之一，它一直是困擾奶牛業(yè)經(jīng)濟效益及迅速發(fā)展的重要原因之一，隱性乳房炎是乳房炎的一種，流行面廣，為臨床型乳房炎的15～40倍，引起奶產(chǎn)量降低4%～10%，影響牛奶質(zhì)量，并易轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床型乳房炎，造成更為嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[1]。引起隱性乳房炎的因素有多種，如物理、化學(xué)、機械、微生物感染等，其中葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原物之一，據(jù)報道約有1/2以上的乳房炎都是由該細(xì)菌引起的，對奶牛乳腺組織造成損傷，使產(chǎn)奶量降低，奶牛的使用年限大大縮短，牛奶的品質(zhì)和營養(yǎng)價值受到影響，還制約著乳品加工業(yè)的健康發(fā)展，給乳制品工業(yè)帶來巨大損失[2]。

近年來，隨著我國牛奶業(yè)的發(fā)展，在葡萄球菌方面關(guān)注度越來越高，對于葡萄球菌的研究也越來越深入，基本鑒定方法有4種，包括血漿凝固酶法、DNA分解酶法、甘露醇發(fā)酵試驗、溶血現(xiàn)象。其中金黃色葡萄球菌不僅影響奶牛的泌乳量而且嚴(yán)重影響乳汁的衛(wèi)生質(zhì)量，它與鏈球菌、大腸桿菌所引起的乳房炎約占奶牛乳房炎的90%以上[3-4]。

本研究從新鮮牛奶中分離引起隱性乳房炎的金黃色葡萄球菌，通過細(xì)菌的培養(yǎng)、染色鑒定、生理生化試驗，對病原菌進(jìn)行鑒定，鑒定后進(jìn)行藥敏試驗，以期獲得敏感性的抗生素，為隱性乳房炎的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為新鮮牛奶，采自蒙自養(yǎng)殖戶，無菌采集后帶回試驗室在4 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨普通培養(yǎng)基，血皿普通培養(yǎng)基，麥康卡培養(yǎng)基，甲基紅培養(yǎng)基，亞硝酸還原培養(yǎng)基，糖類發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(發(fā)酵管)。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)及純化

將樣品按10倍梯度稀釋后，接種在普通瓊脂培養(yǎng)基和血皿培養(yǎng)基上，在37 ℃條件下無氧培養(yǎng)24 h，待菌落長出后，經(jīng)過2種培養(yǎng)基上菌落的對比，在血皿培養(yǎng)基上挑出有溶血圈的可疑菌落，將可疑菌落繼續(xù)接種在以上2種培養(yǎng)基上，并同時接種在麥康卡培養(yǎng)基上，而在前2種培養(yǎng)基中細(xì)菌均能正常生長，在最后一種培養(yǎng)基上則不生長，將這種菌株反復(fù)在普通培養(yǎng)基上培養(yǎng)，劃線分離，直至菌落較純化。待菌株生長良好后，仔細(xì)觀察菌落形態(tài)。

1.4 細(xì)菌形態(tài)鑒定

分離的細(xì)菌首先進(jìn)行革蘭氏染色，后再在顯微鏡下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.5 生理生化鑒定

將分離得到的革蘭氏染色為陽性的細(xì)菌做過氧化氫酶試驗，凡是革蘭氏染色為陽性、過氧化氫酶產(chǎn)生氣泡的細(xì)菌均暫定為葡萄球菌屬，再進(jìn)一步做甲基紅試驗、各種發(fā)酵糖試驗、硝酸還原試驗、血凝固酶試驗。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》來確定所屬的種。

1.6 PCR鑒定

采用CTAB法提取經(jīng)過生理生化鑒定的細(xì)菌DNA，根據(jù)GenBank上發(fā)表的金黃色葡萄球菌16S rRNA序列(NR_075000)，設(shè)計1對特異性引物如下，預(yù)計擴增產(chǎn)物大小為 1 521 bp。

P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，

P2：5′-TCCGATACGGCTACCTTGTTACG-3′。

以細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)條件如下：94 ℃的預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)，72 ℃ 延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴增產(chǎn)物電泳檢測。將檢測正確的PCR產(chǎn)物送交生工生物(上海)股份有限公司測序。將測序結(jié)果與GenBank上發(fā)表的金黃色葡萄球菌16S rRNA序列進(jìn)行同源性比較。

1.7 藥敏試驗

將經(jīng)生理生化鑒定后的細(xì)菌涂布在培養(yǎng)皿上，并把各種藥敏片標(biāo)記后放在該培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)24 h之后觀察結(jié)果。觀察抑菌圈的大小，用抑菌圈大小判定各種藥敏片對細(xì)菌的敏感程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)特征

在血皿培養(yǎng)基上，菌落周圍有溶血現(xiàn)象，出現(xiàn)溶血圈，菌落為圓形，平板形成濕潤、表面光滑、邊緣有些不整齊，呈白色或金黃色，中央有凸起的菌落(圖1)。葡萄球菌的菌體都是圓形的，一般在顯微鏡下觀察是呈葡萄串狀，革蘭氏染色呈陽性(圖2)。

所分離的葡萄球菌的形態(tài)特征，菌落直徑在0.5～1.5 mm 之間，凸起、圓形、光滑、金黃色，偶爾也為白色；細(xì)菌為圓形，通常是以葡萄串狀存在，偶爾有單個，缺乏鞭毛。

2.2 病原菌的生理生化鑒定

本試驗對牛奶中分離得到的葡萄球菌進(jìn)行生理生化鑒定，由表1可知，革蘭氏染色試驗、過氧化氫酶試驗、血凝固酶試驗、甲基紅試驗、硝酸還原試驗等均為陽性，根據(jù)形態(tài)特征和常規(guī)的生理生化鑒定結(jié)果，試驗分離出的細(xì)菌確定為葡萄球菌屬。

表1 分離細(xì)菌的生理生化試驗結(jié)果

注：+為陽性反應(yīng)，-為陰性反應(yīng)。

2.3 病原菌發(fā)酵特性分析

將分離到的葡萄球菌屬的菌株，做進(jìn)一步的發(fā)酵試驗，試驗結(jié)果見表2，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行種的鑒定。

由表2可知，所分離出來的葡萄球菌是金黃色葡萄球菌。

表2 分離株的糖發(fā)酵試驗結(jié)果

注：+為陽性反應(yīng)，-為陰性反應(yīng)。

2.4 病原菌的PCR鑒定

經(jīng)生理生化鑒定的病原菌，設(shè)計1對金黃色葡萄球菌16S rRNA特異性引物，以病原菌DNA為模板，進(jìn)行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。由圖3可知，PCR產(chǎn)物大小1 521 bp，與預(yù)期大小一致。由圖4可知，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后發(fā)現(xiàn)與GenBank登錄的金黃色葡萄球菌16S rRNA(NR_075000)有2個核苷酸的差異，證明分離的病原菌為金黃色葡萄球菌。

2.5 病原菌藥敏試驗結(jié)果

參照美國臨床試驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會1994年制定的抗生素敏感度判斷標(biāo)準(zhǔn)(NCCLS1994)判斷抑菌結(jié)果。抑菌圈直徑>15 mm 為高敏感度抑菌作用，用“+++”表示；10 mm<抑菌圈直徑<15 mm為中敏感度抑菌作用，用“++”表示；抑菌圈直徑<10 mm為低敏感度抑菌作用，用“+”表示；抑菌圈直徑<5 mm的為無抑菌作用，用“-”表示。

由表3可知，分離得到的葡萄球菌對萬古霉素和頭孢噻吩敏感度高，對慶大霉素、四環(huán)素、青霉素為中度敏感，對于四環(huán)素和諾氟沙星敏感度低，而對于環(huán)丙沙星不敏感。

3 討論

3.1 分離培養(yǎng)基的選擇

從不同的基質(zhì)中分離葡萄球菌時，據(jù)葡萄球菌的生長環(huán)境條件以及它在不同培養(yǎng)基上生長的情況進(jìn)行培養(yǎng)基的組分選擇[5]。對于葡萄球菌的分離，多數(shù)人選擇有色培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)。本試驗所用的培養(yǎng)基是普通培養(yǎng)基(培養(yǎng)細(xì)菌)，而一些常見的病原菌也可以在普通培養(yǎng)基上生長，如鏈球菌、大腸桿菌等在普通培養(yǎng)基上生長，但鏈球菌生長差，有時不生長。大腸桿菌雖然生長旺盛，但是它的菌落大小和形態(tài)與葡萄球菌是完全不同的，因此降低了分離的難度。

3.2 細(xì)菌的分離鑒定

細(xì)菌的分離鑒定方法很多，可以是常規(guī)的生化鑒定，也可以是分子生物學(xué)鑒定，包括DNA測定、PCR技術(shù)、血清鑒定等。得益于現(xiàn)在技術(shù)的發(fā)達(dá)，較多的人是采用分子鑒定方法，利用分子鑒定能更快速地鑒定出結(jié)果[6]。本試驗是用的常規(guī)生化鑒定方法結(jié)合分子生物學(xué)方法，能快速準(zhǔn)確鑒定出分離的病原菌。

表3 藥敏試驗抑菌圈的平均直徑

注：直徑長度用mm表示。

3.3 分離菌的耐藥性

根據(jù)所查的資料，劉軍等是用菌株數(shù)來表示該菌對各種藥敏片的耐藥性，他們試驗的結(jié)果是青霉素、四環(huán)素的耐藥性較差，本研究是用抑菌圈表示各種藥片對該菌的敏感程度，根據(jù)抑菌圈的大小判斷可知，青霉素和四環(huán)素的抑菌圈較小，表示耐藥性較強；諾氟沙星和環(huán)丙沙星的抑菌圈最小，耐藥性最差，由此可見該細(xì)菌對于這幾種藥已經(jīng)產(chǎn)生了抗性[7-8]。為了在今后的治療中不讓菌株產(chǎn)生抗藥性，應(yīng)擴大抗生素應(yīng)用的廣譜性，抗生素之間試行交叉使用。本研究結(jié)果說明在不同地區(qū)葡萄球菌對各種抗生素的抗性不同，耐藥性也是有差別的，研究結(jié)果可以為當(dāng)?shù)仡A(yù)防奶牛乳房炎的發(fā)生與流行奠定基礎(chǔ)[9-10]。

本試驗采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定方法，再根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》鑒定出從牛奶中分離出來的葡萄球菌，并根據(jù)各種生理生化試驗鑒定出它是致病性金黃色葡萄球菌。根據(jù)本試驗藥敏片產(chǎn)生的抑菌圈大小可知，萬古霉素和頭孢噻吩的抑菌圈最大，平均在15 mm以上，對細(xì)菌的敏感度高；慶大霉素、紅霉素和青霉素的抑菌圈在10～15 mm之間，敏感度中；四環(huán)素和諾氟沙星的抑菌圈在5～10 mm 之間，敏感度低；環(huán)丙沙星的抑菌圈在5 mm以下，對細(xì)菌不敏感。

參考文獻(xiàn)：

[1]史冬艷，郝永清，張愛榮，等. 奶牛金黃色葡萄球菌性乳房炎研究進(jìn)展[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31(7)：82-86.

[2]李明杰. 奶牛乳房炎的危害及綜合防治措施[J]. 畜牧與飼料科學(xué)，2009，30(3)：172-172.

[3]李淑芳，張繼東，李 茜，等. 奶牛乳房炎乳致病性葡萄球菌的分離鑒定及生化分型[J]. 今日畜牧獸醫(yī)，2008，24(5)：7-8，56.

[4]柳旭偉，王精梅，剡根強. 牛源金黃色葡萄球菌的分離培養(yǎng)及鑒定[J]. 當(dāng)代畜牧，2005，28(11)：16-17.

[5]梁 璐，陳 冰. 乳腺膿腫分離到葡萄球菌的鑒定和藥敏分析[J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2009，25(11)：1671-1673.

[6]尹柏雙，李國江. 奶牛乳房炎的研究新進(jìn)展[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2010，37(2)：182-184.

[7]楊有武. 青海地區(qū)奶牛乳房炎葡萄球菌的分離鑒定與藥敏試驗[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2011，38(10)：171-174.

[8]秦 梅. 奶牛乳房炎葡萄球菌的分離鑒定及萬古霉素等其它抗生素耐藥性情況調(diào)查[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007：6-8.

[9]覃艷華，謝 和，胡 萍，等. 原料奶中金黃色葡萄球菌分離鑒定及產(chǎn)毒菌株的快速檢測[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(5)：140-143，146.

[10]魯懷偉，馬筱玲. 葡萄球菌的分離鑒定及藥敏分析[J]. 蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2003，28(4)：358-360.