宋立立， 頓寶慶， 張亞楠， 田景漢

(1.滄州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北滄州 061000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院作物科學(xué)研究所/國家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程/生物質(zhì)能源研究中心，北京 100081)

木聚糖是植物半纖維素的主要成份，是除纖維素之外自然界中最為豐富的多糖，也是自然界中最為豐富的可再生資源之一[1]。半纖維素在秸稈中僅次于纖維素，是可再生資源，但是大部分被作為廢棄物浪費。我國秸稈資源豐富，將秸稈中的半纖維素轉(zhuǎn)化為可利用資源是一個尚待解決的問題。木聚糖酶是木聚糖降解中最關(guān)鍵的酶，可以使木聚糖分子中β-1，4糖苷鍵斷裂，水解產(chǎn)物為木二糖和木寡糖。木聚糖酶在能源工業(yè)、造紙制漿、食品、紡織、飼料等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[2-3]。用木聚糖酶對含半纖維素的紙漿進行處理，可以減少漂白工藝中化學(xué)的用量，減輕對環(huán)境的污染，還可以提高紙漿的漂白度；木聚糖酶還可以作為飼料添加劑來提高飼料的利用率，改善飼料的營養(yǎng)價值；制酒工業(yè)添加木聚糖酶降低非淀粉多糖的含量，使后期易于過濾，酒色變澄清。國內(nèi)已經(jīng)成功構(gòu)建了木聚糖酶工程菌株，但是和國外相比有著一定的差距，對木聚糖酶的研究較晚，因此，對木聚糖酶工程菌的進一步研究是有必要的。本研究通過分子生物學(xué)技術(shù)從桔青霉中克隆得到編碼木聚糖酶基因，將其在畢赤酵母GS115和大腸桿菌BL21進行了表達研究，為木聚糖酶作為酶制劑應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基參照《分子克隆實驗指南》配制。酵母YPD培養(yǎng)基、選擇MD培養(yǎng)基、誘導(dǎo)表達BMGY和BMMY培養(yǎng)基均根據(jù)Invitrogen公司畢赤酵母表達操作手冊配制。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 含有木聚糖酶的桔青霉菌株由筆者所在實驗室篩選得到；克隆宿主菌EscherichiacoliDH5α、畢赤酵母菌GS115、大腸桿菌BL21為實驗室保存。表達載體pPAL7購自BIO-RAD公司；pPIC9K購自Invitrogen公司。

1.1.3 主要酶和試劑 試驗所涉及限制性核酸內(nèi)切酶均購自NEB公司；PGEM-Teasy購自Promega公司；DNA回收、DNA純化和DNA提取試劑盒均購自TaKaRa公司；DNA連接酶購買自Promega公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自天根公司；氨芐青霉素購自Sigma公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 緩沖液配制 配制方法參照《分子克隆實驗指南》。

1.2.2 桔青霉CR-2的RNA提取 提取方法參照RNA提取試劑盒操作說明書。

1.2.3 RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA 操作過程參照《分子克隆實驗指南》。

1.2.4 木聚糖酶基因片段的擴增 根據(jù)木聚糖酶基因cDNA序列設(shè)計引物，真核表達系統(tǒng)引物為P1：5′-TACGTAATGATTAAGTCTAA-3′；P2：5′-GAATTCTTACCA CACCGTTA-3′，下劃線分別為SnaBⅠ和EcoRⅠ酶切位點序列。原核表達系統(tǒng)引物為P1：5′-CGTCCATATGATTAAG TCTAAAAAG-3′；P2：5′-GAATTCTTACCACACCGTTA-3′，下劃線分別為NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位點序列。擴增反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.5 質(zhì)粒提取 提取方法參照質(zhì)粒小量提取試劑盒說明書。

1.2.6 轉(zhuǎn)化大腸桿菌[4]

1.2.7 酶切驗證 酶切反應(yīng)體系(μL)：Plasmid DNA 2 μL，10×enzyme Buffer 5 μL，SnaBⅠ 0.5 μL，EcoRⅠ 0.5 μL，補充dd H2O至20 μL。37 ℃過夜酶切(內(nèi)切酶相應(yīng)變化)，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.8 感受態(tài)制備 大腸桿菌DH5α和BL21感受態(tài)的制備參照文獻[5]；酵母菌株GS115感受態(tài)的制備參照文獻[6]。

1.2.9 超聲波破碎菌體 操作過程參照《分子克隆實驗指南》。

1.2.10 酵母的電擊轉(zhuǎn)化 將9 μg的線性化好的DNA片段溶解在12 μL去離子水中，與80 μL的感受態(tài)混勻，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)化杯中4～10 ms進行電擊；電擊后，迅速加入1 mL 1 mol/L預(yù)冷的山梨醇溶液；電擊產(chǎn)物放置30 ℃恢復(fù)30 min，涂于MD平板上，每450 μL涂布1塊平板，將平板置于30 ℃培養(yǎng)，直至單個菌落出現(xiàn)。

1.2.11 表達質(zhì)粒載體的線性化 轉(zhuǎn)化前用ScaⅠ酶切，酶切體系(μL)：pPIC9K-xyl80 μL，10×Buffer 20 μL，ScaI 10 μL，補加dd H2O至200 μL。

1.2.12 真核表達載體的構(gòu)建 將連有xyl基因的克隆用LB液體培養(yǎng)基活化并提取質(zhì)粒。用SnaBⅠ和EcoRⅠ雙酶切質(zhì)粒與pPIC9K載體，回收xyl片段及載體大片段，將2個回收產(chǎn)物連接構(gòu)建表達載體pPIC9K-xyl，構(gòu)建過程如圖1。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到的轉(zhuǎn)化子用SnaBⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確的轉(zhuǎn)化子用于下一步試驗。

1.2.13 畢赤酵母的誘導(dǎo)表達試驗 挑選陽性克隆于20 mL BMGY培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)，28～30 ℃培養(yǎng)至D600 nm為2～6，離心5 min收集菌體，用1/5原培養(yǎng)體積的BMMY重懸菌體；將菌液重新置于100 mL的搖瓶28～30 ℃搖床培養(yǎng)；每隔 24 h 向培養(yǎng)基中添加無水甲醇至終濃度為1.0%；隔24 h取樣，128 000 r/min 離心5 min，收集上清，分析重組菌的活性。取樣時間一般為0、24、48、72、96、120 h。

1.2.14 大腸桿菌的誘導(dǎo)表達試驗 挑選正確的菌落，接入10 mL含100 mg/mL氨芐青霉素LB培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)至D600 nm為0.2～0.6；取100 μL 樣品加入50 mL含100 mg/mL氨芐青霉素LB培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)至D600 nm為0.2～0.6，加IPTG至終濃度0.8 mmol/L，37 ℃培養(yǎng)，每2 h取樣，樣品超聲波破碎后分析其胞內(nèi)表達情況，利用SDS-PAGE等活性試驗檢測與鑒定重組蛋白的表達。

1.2.15 重組蛋白SDS-PAGE檢測 重組蛋白SDS-PAGE檢測操作步驟見參考文獻[7]，蛋白電泳主要試劑配制方法見參考文獻[8-9]。

1.2.16 木聚糖酶活性測定方法 配制10.0 mg/mL的木糖溶液：稱取無水木糖1.000 g，加入去離子水后定容至 100 mL。取8支試管按表1加入試劑，稀釋木糖標準液，再加入3 mL DNS試劑；充分搖勻置于沸水中煮5 min；流動冷水冷卻后，將顯色液以4 000 r/min離心5 min。取上清液，用0號試管作對照，在540 nm下測其他試液的吸光度D540 nm。以吸光度為縱坐標，以木糖濃度為橫坐標繪制標準曲線。

木聚糖酶活性測定方法：取3支試管各加0.5 mL中性木聚糖底物，與待測酶液一起在50 ℃水浴中預(yù)熱5 min。在第1、2試管中加入0.5 mL待測酶液，50 ℃水浴中反應(yīng)15 min。加入3 mL的DNS試劑，在第3支試管中加入0.5 mL的待測酶液，沸水浴5 min。將顯色液(包括空白)以4 000 r/min離心5 min。取上清夜以第3支試管為對照在540 nm條件下測第1、 2試管樣的吸光度D540 nm。吸光度以在0.2～0.3為宜，若不在此范圍可改變稀釋倍數(shù)重做。

表1 酶活性測量用木糖標準曲線溶液配制

酶活性的計算：酶活性(IU/mL或IU/g)=木聚糖等量值÷150÷15÷0.5×n。

式中：150指木糖從微克量換算成微克分子數(shù)；15指待測液與底物的反應(yīng)時間；0.5指與底物反應(yīng)的待測酶液量；n指原酶液(或固體原酶)的稀釋倍數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的片段克隆結(jié)果

PCR產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果表明，在636 bp的位置有一明顯條帶，與公布的基因片段大小相一致(圖2)?；厥諗U增片段連接pGEM-Teasy測序，所測序列與GenBank中報道的木聚糖酶基因序列同源性為99.99%，編碼212個氨基酸。將所得到的木聚糖酶基因作原核表達和真核系統(tǒng)表達，重組質(zhì)粒pGEM-xyl經(jīng)SnaBⅠ和EcoRⅠ(真核表達)、NdeⅠ和EcoRⅠ(原核表達)雙酶切驗證，酶切后電泳鑒定出2條帶：一條帶為636 bp，與PCR產(chǎn)物帶相同；另一條帶為3 000 bp，與載體pEGM-Teasy的條帶大小一致(2個圖大小相一致，以真核表達系統(tǒng)酶切圖為例，圖3)。結(jié)果表明，初步獲得了木聚糖酶編碼基因xyl。

2.2 表達載體的構(gòu)建

原核表達載體(pPAL7)和真核表達載體(pPIC9K)的構(gòu)建方法一致，同時雙酶切載體質(zhì)粒和pGEM-xyl陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物同時回收，回收產(chǎn)物和表達載體過夜酶連，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α；重組子經(jīng)雙酶切驗證，在真核表達載體中，質(zhì)粒經(jīng)SnaBⅠ和EcoRⅠ雙酶切電泳檢測如圖4所示，在636、9 000 bp有2條明顯的條帶，分別與擴增產(chǎn)物和載體大小相一致；在原核表達系統(tǒng)中，重組子質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切電泳檢測，在636、5 641 bp處有2條與預(yù)期大小相一致的條帶(圖5)，初步表明，該重組子含有木聚糖酶編碼基因。驗證正確的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21和酵母GS115進行誘導(dǎo)表達試驗。

2.3 木糖酶在原核系統(tǒng)和真核系統(tǒng)中的表達分析

2.3.1 SDS-PAGE分析(原核表達系統(tǒng)) 用IPTG對重組菌進行不同時間的誘導(dǎo)，表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳分析，在22 ku處呈現(xiàn)表達蛋白條帶，與理論蛋白大小相一致(圖6)，根據(jù)誘導(dǎo)時間與表達量的關(guān)系，37 ℃條件下誘導(dǎo)6 h蛋白表達量最高。

2.3.2 木糖標準曲線 由圖7可知，標準曲線方程為y=0.005 4x-1.077 6(x軸為木糖濃度，y軸為D540 nm)，根據(jù)標準方程可以計算出還原糖濃度，根據(jù)木聚糖酶酶活性計算公式求出酶活性，酶活性單位為IU/mL。

2.3.3 木聚糖酶基因在原核系統(tǒng)中的表達 在原核表達系統(tǒng)中，重組子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，每隔2 h取樣，測定其酶活性(圖8)，誘導(dǎo)6 h時酶活性最高，達到2.07 IU/mL。

2.3.4 木聚糖酶基因在真核系統(tǒng)中的表達 在真核表達系統(tǒng)中，重組子經(jīng)甲醇誘導(dǎo)，每間隔24 h取樣，測定其酶活性，誘導(dǎo)96 h時酶活性最高，達到23.84 IU/mL(圖9)。

2.3.5 木聚糖酶基因氨基酸保守序列分析 根據(jù)NCBI比對木聚糖酶氨基酸的保守序列分析，該酶屬于11家族糖基水解酶，保守序列有28～211個氨基酸序列，與許多菌種的氨基酸保守序列同源性很高(圖10)。

3 小結(jié)

根據(jù)已經(jīng)報道的桔青霉菌中木聚糖酶基因的同源序列設(shè)計引物，提取桔青霉的RNA，通過RT-PCR擴增得到木聚糖酶的編碼基因xyl，結(jié)果進行比對分析，閱讀框編碼212個氨基酸，表達蛋白分子量大小為22 ku。

木聚糖酶的表達活性分析中，同時測定了在原核系統(tǒng)和真核系統(tǒng)中酶的表達量，發(fā)現(xiàn)木聚糖酶在真核表達系統(tǒng)中的酶活性(23.84 IU/mL)遠遠要高于原核表達系統(tǒng)中的酶活性(2.07 IU/mL)，推測可能原因為該基因來源于真核生物，所以在真核系統(tǒng)中更容易實現(xiàn)表達。本試驗研究木聚糖酶基因的克隆與表達，該工程菌在沒有對載體和基因改造的情況下，對產(chǎn)酶條件未進行優(yōu)化，表達量不是很高。本研究側(cè)重克隆表達，后續(xù)的研究中可通過對該基因和載體進行改造、優(yōu)化其產(chǎn)酶條件來提高酶的活性。

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