李耀國(guó)， 孫 彤， 武文麗， 陳永志， 蔣丹尼

(海南熱帶海洋學(xué)院生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院，海南三亞 572022)

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)，是參與糖酵解等能量代謝反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，還具有修復(fù)DNA、調(diào)節(jié)組蛋白、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等一系列功能，是一種參與多種亞細(xì)胞水平活動(dòng)的多功能蛋白質(zhì)[1]。GAPDH廣泛存在于眾多生物體中，在細(xì)胞中含量占總蛋白質(zhì)的10%～20%；種屬間序列高度保守，因在同種細(xì)胞或不同組織中蛋白質(zhì)表達(dá)量相對(duì)恒定而常作為管家基因[2]。其分子一般為4個(gè)相同亞基構(gòu)成的四聚體，每個(gè)亞基含催化結(jié)構(gòu)域和輔酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域[3]。水產(chǎn)動(dòng)物中已有GAPDH基因的cDNA全長(zhǎng)序列克隆及相關(guān)研究。如半滑舌鰨GAPDH基因的開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)序列為1 002 bp，編碼333個(gè)氨基酸的多肽鏈[4]。外因刺激可以改變GAPDH的表達(dá)水平，雌性食蚊魚(yú)暴露在不同濃度雙氯芬酸鈉后肝臟GAPDH的表達(dá)量出現(xiàn)顯著變化[5]。

DNA鏈上存在一種甲基化修飾，被視為基因表達(dá)的“沉默標(biāo)記”，它可通過(guò)甲基基團(tuán)的空間位阻效應(yīng)或促使阻抑蛋白與甲基化DNA相結(jié)合而抑制基因表達(dá)[6]。去甲基化試劑5-氮雜胞苷能整合到DNA鏈中，抑制甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性使基因或基因組去甲基化，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[7-8]。

馬氏珠母貝(Pinctadafucata)是中國(guó)南部沿海廣泛分布的一種珍珠貝。目前，尚未見(jiàn)馬氏珠母貝GAPDH基因全長(zhǎng)cDNA序列的相關(guān)報(bào)道。本研究對(duì)馬氏珠母貝GAPDH基因的全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行了克隆及生物信息學(xué)分析，并探索了去甲基化試劑對(duì)受精卵中GAPDH基因表達(dá)水平的影響，以期為后續(xù)GAPDH的功能研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)用馬氏珠母貝采集自中國(guó)科學(xué)院大亞灣海洋生物綜合實(shí)驗(yàn)站(深圳)，于實(shí)驗(yàn)基地海水池中暫養(yǎng)1周。取健康馬氏珠母貝外套膜組織，迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃液氮罐中保存待用。此外，設(shè)立3組馬氏珠母貝雌、雄親本單對(duì)配對(duì)的人工授精試驗(yàn)。分別將每組單對(duì)配對(duì)親本產(chǎn)生的精子和卵細(xì)胞混合形成受精卵，并將每組分成兩大部分，對(duì)照組采用滅菌海水處理10 min，試驗(yàn)組用10-5mol/L 5-氮雜胞苷溶液處理 10 min。處理后分別采集各組受精卵樣品于液氮保存待用。

1.2 核酸提取及cDNA模板合成

樣品總RNA的提取按照廣州美基公司的核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，提取后的RNA稀釋于超純水中，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop分光光度計(jì)D260 nm/D280 nm值分析核酸的完整性和測(cè)定核酸濃度。RACE試驗(yàn)所用cDNA模板合成按SMARTerTMRACE(rapid amplification of cDNA ends)cDNA Amplification Kit(Clontech，USA)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。熒光定量PCR檢測(cè)所用cDNA模板按照ReverTra Ace-first-strand cDNA synthesis kit(TOYOBO，Japan)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行合成。

1.3 GAPDH cDNA全長(zhǎng)序列克隆

基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得馬氏珠母貝對(duì)應(yīng)GAPDH基因的Unigene序列(603 bp)，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)RACE PCR所需正、反向引物，引物由華大基因廣州分公司合成。引物分別為5′ 端RACE外引物GARA5-1和5′ 端內(nèi)引物GARA5-2；3′ 端RACE外引物GARA3-1和3′ 端內(nèi)引物GARA3-2。RACE PCR外擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25 μL，包含：12.5 μL Premix ExTaq(TaKaRa，大連)，1 μL cDNA模板，1 μL 10 pmol/L 基因5′端或3′端外引物，1 μL 10 pmol/L的UPM mix引物(由UPM long和UPM short引物混合配制而成)，加ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；5個(gè)循環(huán)的94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min；15個(gè)循環(huán)的94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min；15個(gè)循環(huán)的94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min；最后在72 ℃下延伸5 min。將第一輪RACE外擴(kuò)增PCR產(chǎn)物稀釋30倍作為第二輪內(nèi)擴(kuò)增PCR反應(yīng)的模板，內(nèi)擴(kuò)增PCR體積為25 μL ∶12.5 μL Premix ExTaq，1 μL稀釋的產(chǎn)物模板，1 μL對(duì)應(yīng)的 5′ 端或3′ 端10 pmol/L內(nèi)引物，1 μL 10 pmol/L NUP引物，加ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；35個(gè)循環(huán)的94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min；72 ℃下延伸5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，切取單一條帶，膠純化，送華大基因廣州分公司轉(zhuǎn)菌落測(cè)序。

1.4 序列分析

通過(guò)NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)中Blast程序進(jìn)行2個(gè)序列比對(duì)分析，將獲得的5′端或3′端cDNA序列以及轉(zhuǎn)錄組GAPDH對(duì)應(yīng)Unigene序列進(jìn)行拼接得到GAPDH基因全長(zhǎng)cDNA序列。GAPDH基因的開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)由NCBI中在線(xiàn)軟件ORF Finder分析完成。利用ProtParam軟件分析該基因的蛋白質(zhì)分子量、理論等電點(diǎn)等信息。SignalP-4.1 server http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)GAPDH蛋白的信號(hào)肽序列。在線(xiàn)軟件TMHMM Server 2.0預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)，PSORT Prediction軟件預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位點(diǎn)。蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)由Swiss-Model在線(xiàn)服務(wù)器(http：//swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行預(yù)測(cè)。GAPDH蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列同源性比對(duì)由ClustalW1.83軟件完成，利用MEGA 5.0軟件共同完成系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建(采用鄰接法，并設(shè)置Bootstrap值為1 000)。

1.5 熒光定量分析

基于獲得的GAPDHcDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物GAPDHF和GAPDHR進(jìn)行基因表達(dá)量檢測(cè)。對(duì)馬氏珠母貝3個(gè)單對(duì)配對(duì)親本產(chǎn)生的對(duì)照組和試驗(yàn)組受精卵樣品中GAPDH的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，選用的內(nèi)參基因?yàn)轳R氏珠母貝18S(GenBank登錄號(hào)：AY028625.1，引物為18S F和18S R)。熒光定量PCR反應(yīng)在Roche LightCycler480儀器中進(jìn)行。反應(yīng)體系如下：5 μL 2×SYBR Premix ExTaqTM(TaKaRa)，1 μL模板cDNA，熒光定量引物各0.4 μL(10 μmol/L)，加3.2 μL去離子水使總體積為10 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 1 min；45個(gè)循環(huán)的95 ℃ 5 s，54 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s。PCR產(chǎn)物特異性根據(jù)溶解曲線(xiàn)作出判斷，基因的相對(duì)表達(dá)量通過(guò)Ct方法計(jì)算。利用SPSS 19.0軟件卡方檢驗(yàn)比較組間GAPDH基因表達(dá)水平差異，顯著性水平設(shè)置為P<0.05，本試驗(yàn)中所有引物序列見(jiàn)表1。

表1 GAPDH基因cDNA克隆及熒光定量表達(dá)引物

2 結(jié)果與分析

2.1 GAPDH基因cDNA全長(zhǎng)序列的獲得

基于馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得GAPDHUnigene序列進(jìn)行RACE PCR。擴(kuò)增得到了長(zhǎng)度為281 bp的5′端和 1 088 bp 的3′端產(chǎn)物(圖1)。拼接5′末端序列、3′末端序列和Unigene序列得到了全長(zhǎng)為1 174 bp的GAPDH基因cDNA序列。該cDNA序列的ORF長(zhǎng)度為1 014 bp，編碼337個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)AA。序列的5′端存在38 bp的非翻譯區(qū)，3′端存在122 bp的非翻譯區(qū)(圖2)。

2.2 GAPDH基因編碼蛋白質(zhì)特征分析

對(duì)GAPDH基因編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示其所編碼蛋白質(zhì)的原子總數(shù)為5 068，蛋白質(zhì)分子量為36.04 ku，理論等電點(diǎn)為7.66，不穩(wěn)定系數(shù)值為 23.89，屬于穩(wěn)定蛋白。該蛋白序列經(jīng)預(yù)測(cè)不具有信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。GAPDH蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位分析顯示該蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)中的可能性最大(69.6%)。該蛋白具有1個(gè)甘油醛-3-磷酸脫氫酶NAD結(jié)合域以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶C末端結(jié)構(gòu)域。用SWISS-MODEL在線(xiàn)分析對(duì)馬氏珠母貝GAPDH編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了建模預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖3所示(模型為馬來(lái)絲蟲(chóng)的GAPDH蛋白，SMTL id：4k9d.1)。

2.3 GAPDH基因序列比對(duì)與系統(tǒng)樹(shù)分析

用ClustalW1.83軟件將馬氏珠母貝GAPDH氨基酸序列與章魚(yú)(Octopusbimaculoides，XP_014786157.1)、 厚殼玉黍螺(Littorinalittorea，AJA37895.1)、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus，BAF43305.1)、紅鰭東方鲀(Takifugurubripes，NP_001267044.1)、孔雀魚(yú)(Poeciliareticulata，XP_008429670.1)、尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus，XP_005455495.1)、尖吻鱸(Latescalcarifer，XP_018538252.1)、絲蟲(chóng)(Loaloa，EJD75047.1)、布氏鼠耳蝠(Myotisbrandtii，XP_005873775.1)、橙腹草原田鼠(Microtusochrogaster，XP_005365298.1)、灰地鼠(Cricetulusgriseus，NP_001231783.1 )、密西西比短吻鱷(Alligatormississippiensis，XP_006258426.1)、中華鱉(Pelodiscussinensis，NP_001273856.1)、綠海龜(Cheloniamydas，ALU11325.1)、東部烏梢蛇(Thamnophissirtalis，XP_013923068.1)、新疆北鯢(Ranodonsibiricus，AMA21735.1)、眼斑雀鱔(Lepisosteusoculatus，XP_006642411.1)和小孢根霉(Rhizopusmicrosporus，CEG72784.1)的GAPDH氨基酸序列進(jìn)行多重比較，發(fā)現(xiàn)共有177個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)為完全保守位點(diǎn)(圖4)。對(duì)上述物種的GAPDH進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)馬氏珠母貝GAPDH蛋白首先與軟體動(dòng)物門(mén)的厚殼玉黍螺(Littorinalittorea，AJA37895.1)進(jìn)行聚類(lèi)，然后與同是軟體動(dòng)物門(mén)的章魚(yú)(Octopusbimaculoides，XP_014786157.1)進(jìn)行聚類(lèi)，進(jìn)化樹(shù)親緣關(guān)系與動(dòng)物分類(lèi)學(xué)地位一致(圖5)。

2.4 去甲基化試劑處理受精卵中GAPDH表達(dá)檢測(cè)

熒光定量PCR檢測(cè)顯示，經(jīng)去甲基化試劑5-氮雜胞苷溶液處理后，GAPDH基因在馬氏珠母貝受精卵中的表達(dá)水平上升，其表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(滅菌海水處理)受精卵樣品中的表達(dá)量(P<0.05)(圖6)。

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)RACE技術(shù)克隆獲得了馬氏珠母貝GAPDH基因cDNA全長(zhǎng)序列(GenBank登錄號(hào)：KX129947.1)。該基因全長(zhǎng)1 174 bp，其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1 014 bp，編碼337個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為36.04 ku，該蛋白具甘油醛-3-磷酸脫氫酶NAD結(jié)構(gòu)域和甘油醛-3-磷酸脫氫酶C末端結(jié)構(gòu)域。在糖酵解過(guò)程中，這2個(gè)結(jié)構(gòu)域可結(jié)合3-磷酸甘油醛和NAD+，催化3-磷酸甘油醛轉(zhuǎn)變?yōu)?，3-二磷酸甘油酸，并以NAD+為受氫體生成NADH[3]。GAPDH蛋白的氨基酸序列在物種間保守性高，該研究比對(duì)物種中共有177個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)為完全保守位點(diǎn)。馬氏珠母貝GAPDH蛋白與同屬軟體動(dòng)物門(mén)的厚殼玉黍螺和章魚(yú)的親緣關(guān)系相近，這與它們均為軟體動(dòng)物的分類(lèi)學(xué)地位一致。

定量檢測(cè)基因表達(dá)時(shí)，目的基因的表達(dá)量需與參考基因表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，GAPDH基因常被用作參考基因。如GAPDH基因在家蠅的不同發(fā)育時(shí)期及組織和不同飼養(yǎng)條件下表達(dá)穩(wěn)定，可作為基因定量表達(dá)檢測(cè)的內(nèi)參基因[9]。理想的內(nèi)參基因應(yīng)在各類(lèi)型細(xì)胞、不同組織及不同處理?xiàng)l件下均表達(dá)量恒定，而研究發(fā)現(xiàn)大多常用的內(nèi)參基因表達(dá)并不穩(wěn)定，會(huì)影響到實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性[10-11]。GAPDH基因在嚴(yán)重?cái)⊙Y病人血液中的表達(dá)量較正常人中的表達(dá)量顯著升高[12]。利用3種軟件分析藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚(yú)候選內(nèi)參基因EF-1α、18S rRNA和GAPDH在不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果顯示GAPDH表達(dá)量是最不穩(wěn)定的[13]。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了馬氏珠母貝GAPDH、β-肌動(dòng)蛋白和18S rRNA共3個(gè)基因在不同組織、性腺發(fā)育時(shí)期、胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)量最穩(wěn)定，18S核糖體RNA在性腺發(fā)育階段表達(dá)最穩(wěn)定，而GAPDH基因在3個(gè)試驗(yàn)組中均顯示為穩(wěn)定性最差[14]。

基因核苷酸序列變異及其上的表觀遺傳修飾均可引起基因表達(dá)量的變化。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)馬氏珠母貝外套膜基因組DNA甲基化水平與galectin基因的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，而galectin啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與基因表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，DNA甲基化可能對(duì)galectin基因的表達(dá)具調(diào)控作用[15]。本研究中發(fā)現(xiàn)馬氏珠母貝受精卵經(jīng)去甲基化試劑5-氮雜胞苷處理后，GAPDH基因表達(dá)水平較對(duì)照組顯著上升(P<0.05)。據(jù)此可推測(cè)，馬氏珠母貝GAPDH基因表達(dá)升高可能是去甲基化修飾所致，而其不適合作為內(nèi)參基因的可能原因是不同條件下基因甲基化修飾變化所引起的基因表達(dá)水平變化。

本研究獲得了馬氏珠母貝GAPDH基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并利用去甲基化試劑(5-氮雜胞苷)處理受精卵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GAPDH基因表達(dá)量顯著升高。本研究結(jié)果為今后GAPDH基因的功能研究及表達(dá)調(diào)控機(jī)制分析提供了基礎(chǔ)及思路。

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