鐘麗凡， 呂長平， 許文婷， 陳海霞

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南長沙 410128)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)為芍藥科(Paeniaceae)芍藥屬(PaeoniaL.)牡丹組(Sect.Moutan DC.)植物，是我國特有的植物種質(zhì)資源[1-3]。我國牡丹品種多樣，觀賞牡丹分布地區(qū)以西北地區(qū)為主。湖南也是牡丹自然分布地區(qū)之一，其品種耐高溫高濕、抗病蟲害，但花色單一、花型簡單缺乏觀賞價(jià)值。因此，如何將觀賞牡丹與湖南牡丹的優(yōu)良特性結(jié)合成為當(dāng)前推廣湖南牡丹的首要任務(wù)。

目前牡丹育種工作主要以人工定向雜交選擇為主[4-5]。但現(xiàn)有湖南牡丹品種大多數(shù)親緣不清，對(duì)湖南具體牡丹品種數(shù)的統(tǒng)計(jì)比較籠統(tǒng)，存在育種工作效率低下、品種出新率低的問題。因此，研究清楚湖南本土牡丹種質(zhì)資源親緣關(guān)系與遺傳多樣性對(duì)后續(xù)的選育工作至關(guān)重要。

簡單重復(fù)序列區(qū)間(inter-simple sequence repeat，簡稱ISSR)分子標(biāo)記，由簡單重復(fù)序列(SSR)標(biāo)記技術(shù)發(fā)展而來，ISSR分子標(biāo)記結(jié)合了隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomly amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD)的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了RAPD、SSR、限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP)等技術(shù)的缺點(diǎn)[6-7]，具有高效、快速、穩(wěn)定、易操作、成本低等優(yōu)點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于親緣關(guān)系鑒定、種質(zhì)資源遺傳多樣性分析等領(lǐng)域。本試驗(yàn)采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)湖南本土牡丹親緣關(guān)系和遺傳多樣性進(jìn)行研究，為選育優(yōu)良牡丹品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

通過走訪湖南當(dāng)?shù)亓謽I(yè)和農(nóng)業(yè)部門、公司、企業(yè)、個(gè)體從業(yè)愛好者，對(duì)栽培時(shí)間長、來源不清的湖南牡丹種質(zhì)資源進(jìn)行調(diào)查。2014—2016年于開花期(3月下旬至4月上旬)、種子成熟期(7月下旬)、引種期(10月中下旬)在湖南牡丹的主要產(chǎn)地(邵陽、湘西、長沙)對(duì)資源識(shí)別、掛牌標(biāo)記、形態(tài)特征、觀賞特性及生長情況進(jìn)行調(diào)查，共收集了18份性狀穩(wěn)定、植株平均年齡10年以上的湖南本土牡丹品種(表1)。采集牡丹新鮮嫩葉保存于-80 ℃冰箱。

1.2 DNA提取與檢測(cè)

采用筆者所在實(shí)驗(yàn)室改良的十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB)法進(jìn)行提取，提取的樣品用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)量濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳粗略檢測(cè)樣品DNA的濃度與純度，最后稀釋標(biāo)定為50 ng/μL，保存到-20 ℃冰箱備用。

1.3 ISSR-PCR優(yōu)化反應(yīng)體系和引物篩選

1.3.1 ISSR-PCR基本反應(yīng)體系 通過多次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，篩選出2×TransTaqHigh Fidelity PCR SuperMixⅠ(內(nèi)含適量的Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶)作為總的反應(yīng)環(huán)境。25 μL PCR反應(yīng)體系：2×TransTaqHigh Fidelity PCR Super MixⅠ 12.5 μL、引物(10 μmol/L)1 μmol/L、模板(50 ng/μL)50 ng，最后加入ddH2O補(bǔ)足25 μL。

表1 18份牡丹品種及來源

1.3.2 ISSR-PCR優(yōu)化反應(yīng)體系 按照L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法[8-10]，進(jìn)行體系總體積、模板濃度、瓊脂糖濃度的正交組合，每個(gè)處理重復(fù)3次(表2)，最終建立的最佳反應(yīng)體系：20 μL反應(yīng)總體積，模板濃度30 ng/μL，瓊脂糖濃度1.5%。然后在BIO-RAD PowerPac HV下以110 V的恒定電壓電泳30 min，最后用凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD Gel DocTMXR+)拍照分析。

擴(kuò)增反應(yīng)在Applied Biosystems 9902 PCR儀上進(jìn)行，PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，50～60 ℃ 45 s，72 ℃ 1.50 min，共計(jì)35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存[11]。

表2 ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)

1.3.3 引物篩選 選用哥倫比亞大學(xué)(UBC)開發(fā)的ISSR 100個(gè)通用引物[12-13]，利用優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行引物篩選，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成；引物退火溫度參照相關(guān)研究[4，11-12]。最后從100條引物中篩選出11條條帶清晰、重復(fù)性好的引物。

1.4 圖譜分析

圖譜以0、1數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，在同一引物、同一位點(diǎn)根據(jù)條帶的有(1)、無(0)形成原始數(shù)據(jù)矩陣(0、1)矩陣[14-17]。利用PopGen32軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)比例(PPB)、Shannon’s信息指數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)等。用NTSYS2.10軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)和構(gòu)建品種親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹DNA提取結(jié)果

牡丹基因組DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，每個(gè)點(diǎn)樣孔包括5 μL樣品DNA和1 μL 上樣緩沖液，各個(gè)條帶大小基本一致，基本無拖尾現(xiàn)象(圖1)。

2.2 ISSR-PCR體系篩選結(jié)果

反應(yīng)體系(20 μL)如下：2×TransTaqHigh Fidelity PCR SuperMixⅠ 10 μL、DNA模板(30 ng/μL)1 μL、引物1 μL、ddH2O 8 μL。用1.5%瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行電泳。由圖2可以看出，條帶數(shù)量多且清晰可見，易于區(qū)分。

2.3 引物擴(kuò)增結(jié)果

11條引物共擴(kuò)增出162條條帶，多態(tài)性條帶133條，平均多態(tài)性比例82.6%。其中，引物UBC811擴(kuò)增的條帶數(shù)最多，為22條，多態(tài)性比例86.4%(圖3、表3)。

2.4 18份牡丹品種遺傳多樣性分析

本試驗(yàn)通過軟件PopGen32分析出供試牡丹品種的有效等位基因數(shù)(Ne)介于1.05～1.90之間，平均值為1.34[12-17]；Shannon’s信息指數(shù)(I)介于0.12～0.60之間，平均值為 0.34；Nei’s(1973)基因多樣性指數(shù)(H)介于0.05～0.40之間，平均值為0.22。

2.5 18份牡丹品種非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，簡稱UPGMA)聚類分析

用NTSYSpc2.1軟件構(gòu)建全部材料UPGMA樹狀圖(圖4)，以相似系數(shù)0.733為閾值可將18份牡丹品種分為三大類。鳳丹白、鳳丹星、鳳丹紫、鳳丹、鳳丹粉被劃為第一大類，共5個(gè)品種，其中鳳丹白與鳳丹星的相似系數(shù)最近，說明它們的親緣關(guān)系最近。第二大類包括鳳丹綠、鳳丹玉、鳳丹綾、鳳丹舞、寶慶紅、寶慶粉共6個(gè)品種。第三大類包括楊山牡丹、永順粉、寧鄉(xiāng)紅、酈家香、紫繡球、湘繡球、湘紫斑。當(dāng)相似系數(shù)值為0.74時(shí)，把18份牡丹品種分為4個(gè)類群，其中C8和C9單獨(dú)分為一類，由此說明鳳丹綠與鳳丹玉2個(gè)品種的遺傳背景與其他品種差異比較大。

表3 ISSR引物及其擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性水平

3 討論

本研究通過反復(fù)試驗(yàn)挑選出混合了Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶在內(nèi)的反應(yīng)體系， 然后從總反應(yīng)體積、 DNA模板濃度、瓊脂糖濃度3個(gè)方面進(jìn)行結(jié)果篩選對(duì)比，最后挑選出了適合大部分引物擴(kuò)增的最適反應(yīng)體系，而且結(jié)果穩(wěn)定，有效地節(jié)省了試驗(yàn)時(shí)間，提高了試驗(yàn)的精確度。

本試驗(yàn)用篩選出的11條引物對(duì)18份湖南本土牡丹資源進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出164條條帶，多態(tài)性比例為81.1%，由此說明湖南本土牡丹資源豐富，品種間存在較豐富的遺傳變異，具有比較復(fù)雜的遺傳背景。

本研究中以NTSYS 2.1作為分析軟件，利用UPGMA法在閾值為0.74時(shí)將供試牡丹品種分為4個(gè)類群[18-20]，分析結(jié)果可以看出，基本品種都顯示出花色和花瓣復(fù)雜程度的優(yōu)勢(shì)優(yōu)先聚合在一起。第一類牡丹品種花色基本都是白色，只有鳳丹粉為粉色，鳳丹紫為紫色，初步分析這2個(gè)品種可能是鳳丹白與非白色系牡丹品種的雜交后代表現(xiàn)出的親本性狀。第二類2個(gè)品種花型偏小，植株比較低矮，所以從聚狀圖上可看出這2個(gè)品種單獨(dú)聚為一類，說明形態(tài)學(xué)鑒定與分子標(biāo)記技術(shù)具有一定的關(guān)聯(lián)性，表明這2個(gè)品種的遺傳性狀相比其他品種差異比較大。第三類中鳳丹綾與鳳丹舞都為白色花，鳳丹綾的花瓣頂部羽狀淺裂，鳳丹舞的花瓣頂部鋸齒狀淺裂，花型都為單瓣型，相似系數(shù)比較大，說明親緣關(guān)系比較近。寶慶紅與寶慶粉2個(gè)品種在形態(tài)學(xué)性狀上基本相似，且在分子標(biāo)記學(xué)上表明它們的親緣關(guān)系很近。第四類幾乎所有的品種花色都比較艷麗，寧鄉(xiāng)紅與酈家香的相似系數(shù)最接近，說明它們的遺傳背景相似；紫繡球與湘繡球花型都為球花臺(tái)閣型，花色比較接近，根據(jù)聚狀圖的分析，它們的親緣關(guān)系比較接近，而湘紫斑的相似系數(shù)最小，說明它們的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。從來源地分析，表明同一地域品種相似度比較高，而且基本是2個(gè)形狀非常相似的品種聚合在一起，推測(cè)是由于近距離的異花授粉而出現(xiàn)的性狀分離的雜交后代。

目前，牡丹新品種選育基本依賴于傳統(tǒng)的人工雜交方法，耗時(shí)長，基本每3年才能進(jìn)行選育；選擇親本的過程比較盲目，而湖南有豐富的牡丹種質(zhì)資源，牡丹品種具有耐高溫、高濕、抗病蟲害的優(yōu)良性狀，充分了解湖南本土牡丹品種的遺傳多樣性與親緣關(guān)系將有助于提高選育的效率與質(zhì)量，從而為觀賞牡丹與湖南本土油用牡丹的雜交提供便利，為牡丹在南方市場的推廣打下基礎(chǔ)。

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