貢莎莎， 孟慶玲， 喬 軍， 鐘文強(qiáng)， 陳 英， 才學(xué)鵬

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅蘭州 730046)

現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，捕食線蟲性真菌——少孢節(jié)叢孢菌產(chǎn)生的侵染性胞外蛋白酶在其侵染線蟲時能夠發(fā)揮重要作用[1-5]。然而，以往的研究多集中在探討捕食線蟲性真菌胞外酶絲氨酸蛋白酶的機(jī)制和功能上，鮮有對捕食線蟲性真菌少孢節(jié)叢孢菌的幾丁質(zhì)酶的相關(guān)報道。Yang等已經(jīng)從少孢節(jié)叢孢菌(Arthrobotrysoligospora)全基因組中鑒定出16個開放閱讀框(ORF)編碼假定的幾丁質(zhì)酶[5]，對其進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域、分子量和轉(zhuǎn)錄分析表明，大多數(shù)幾丁質(zhì)酶在碳源缺乏、含有幾丁質(zhì)底物或植物病原真菌時表達(dá)量上調(diào)，提示少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶可能發(fā)揮重要作用。

少孢節(jié)叢孢菌是目前研究最多的一種捕食線蟲性真菌，在自然界中廣泛分布[2]。2011年，Yang等首次對捕食線蟲性真菌——少孢節(jié)叢孢菌進(jìn)行了全基因組測序[4]，對基因組編碼的侵染性胞外蛋白酶進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，共發(fā)現(xiàn)和鑒定出16個幾丁質(zhì)酶，然而這些幾丁質(zhì)酶的生物學(xué)功能尚未被深入研究。為了研究少孢節(jié)叢孢菌在侵染線蟲中高表達(dá)的幾丁質(zhì)酶AO-801的生物學(xué)功能，本研究對少孢節(jié)叢孢菌 XJ-A1 幾丁質(zhì)酶AO-801基因進(jìn)行克隆，并在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，擬純化獲得重組AO-801蛋白酶，制備高效價的多克隆抗體，為研究少孢節(jié)叢孢菌中該蛋白酶作用的分子機(jī)制奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑

捕食線蟲性真菌少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株XJ-A1、EscherichiacoliDH5α菌株、EscherichiacoliBL21(DE3)菌株和表達(dá)載體pET32a，由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院實驗室保存。2×TaqPCR Master Mix、透析袋，購自廣州東盛生物科技有限公司。PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、pMD19-T載體、組氨酸標(biāo)簽(His-tag)融合蛋白純化柱(SinoBio)，購自TaKaRa公司。EZ Spin Column Fungal RNA Isolation Kits試劑盒，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。鼠抗His抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG，購自北京全氏金生物技術(shù)有限公司。Soluble TMB Substrate Solution，購自天根生化科技(北京)有限公司。T4DNA連接酶，購自Promega公司。。

1.2 幾丁質(zhì)酶AO-801引物的設(shè)計

根據(jù)GenBank中登錄的AO-801基因序列，用Primer 5軟件設(shè)計合成1對特異引物，上、下游引物分別引入EcoR Ⅰ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶位點，上游引物：5′- CCGGAATTC ATGAAGGCCATCTATGGACGTAACT-3′(下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點)，下游引物：5′-CCGCTCGAGTCA AGCGCAAGCGCTGCG-3′(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點)。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.3 幾丁質(zhì)酶AO-801基因的擴(kuò)增與克隆

將少孢節(jié)叢孢菌XJ-A1分離株接種于YPSSA培養(yǎng)基上，于20 ℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1周。取適量菌絲，用TaKaRa真菌RNA提取試劑盒提取XJ-A1分離株RNA，用RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴(kuò)增。20 μL PCR反應(yīng)體系：9 μL H2O2，8 μL PCR Mixture，各0.5 μL上下游引物，2 μL提取的cDNA模板。AO-801基因擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，65 ℃ 40 s，72 ℃ 120 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收。將回收的AO-801基因片段與pMD19-T載體連接后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素抗性平板篩選及菌液PCR驗證后，送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.4 幾丁質(zhì)酶AO-801分子特征分析

將測序結(jié)果與少孢節(jié)叢孢菌標(biāo)準(zhǔn)株[美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，簡稱ATCC) 24927]的幾丁質(zhì)酶AO-801進(jìn)行比對分析，并利用生物在線分析軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/，http：//www.ebi.ac.uk/interpro/，http：//www.expasy.org/tools/，SMART，Prabi，SWISS-MODEL等)進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析。

1.5 原核表達(dá)質(zhì)粒pET-AO801的構(gòu)建

用EcoR Ⅰ和XhoⅠ分別對pMD19-T-AO801和pET32a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收pET32a載體片段和AO-801目的片段，在T4DNA連接酶作用下，于4 ℃過夜連接后轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在氨芐抗性平板上于37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，再經(jīng)菌液PCR和雙酶切方法篩選陽性克隆(命名為pET-AO801)。

1.6 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE和Western Blot分析鑒定

將重組質(zhì)粒pET-AO801轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆于含氨芐抗性的5 mL液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)，再取3mL菌液接種于 200 mL 液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至D600 nm約為0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol/L的誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside，簡稱IPTG)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)6 h后收集菌體，對重組菌的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱SDS-PAGE)和蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)分析。

1.7 重組幾丁質(zhì)酶AO-801的純化及多克隆抗體制備

誘導(dǎo)6 h后于8 000 r/min離心10 min，收集菌體，加 15 mL 裂解液(lysis buffer)裂解菌體，用鎳柱親和層析法純化重組蛋白。將純化的重組蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混勻后按 0.2 mL/只的劑量皮下注射接種給小鼠，14、21 d后再將純化的蛋白與弗氏不完全佐劑混勻并注射小鼠，采血分離血清。

1.8 重組幾丁質(zhì)酶AO-801多克隆抗體效價的測定

用包被緩沖液將純化的重組蛋白稀釋為10 μg/mL，酶標(biāo)板各加入100 μL/孔，4 ℃過夜?？鄹桑尤?00 μL/孔洗滌緩沖液洗3次；用150 μL/孔封閉液于37 ℃封閉1 h；洗滌3次后，加入不同稀釋度的血清，100 μL/孔，37 ℃孵育2h，洗滌清洗5次，每孔加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1 ∶2 000)溶液，37 ℃孵育1 h。洗滌緩沖液清洗5次后，加入100 μL/孔TMB顯色液，37 ℃避光反應(yīng)30 min，加入 100 μL/孔 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

以少孢節(jié)叢孢菌的cDNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1 100 bp，與GenBank中提供的AO-801基因片段大小一致(圖1)。

2.2 測序結(jié)果及序列分析

經(jīng)測序，AO-801基因全長1 448 bp，有3個內(nèi)含子序列，分別位于第139～204、442～513和1 183～1 361位核苷酸，內(nèi)含子具有保守的5′-GT、3′-AG末端，符合真菌內(nèi)含子特征；有1個1 131 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼376個氨基酸，無信號肽序列(圖2)；與少孢節(jié)叢孢菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 24927)的幾丁質(zhì)酶基因AO-801核苷酸序列的同源性為95.96%，氨基酸序列的同源性為97.34%。Scanprosite軟件分析發(fā)現(xiàn)，該幾丁質(zhì)酶屬于糖苷水解酶18家族，其特征序列為第120～128位氨基酸的LDGVDVDWE；有2個高度保守的區(qū)域SIGGW、LDGVDVDWE，SIGGW位于第82～86位氨基酸，為底物結(jié)合位點，LDGVDVDWE位于第120～128位氨基酸，為水解酶催化活性位點。

經(jīng)過SMART在線分析，AO-801編碼的蛋白具有1個Glyco-18結(jié)構(gòu)域，位于第3～333位氨基酸；Interpro軟件預(yù)測結(jié)果顯示，幾丁質(zhì)酶AO-801存在1個幾丁質(zhì)酶插入域，位于第243～304位氨基酸位置(圖3)。SWISS-MODEL軟件的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果(圖4)顯示，幾丁質(zhì)酶AO-801具有(α/β)8的三磷酸異構(gòu)酶(triosephosphate isomerase，簡稱TIM)桶形結(jié)構(gòu)域(簡稱TIM桶)，與煙曲霉YJ-407的幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)相似。

2.3 重組質(zhì)粒pET-AO801的雙酶切鑒定

重組質(zhì)粒pET-AO801經(jīng)PCR和雙酶切鑒定， 得到大小約為1.1 kb的插入片段，與預(yù)期一致(圖5)。測序結(jié)果表明，插入片段大小為1 131 bp，為目的基因片段，表明開放閱讀框正確。

2.4 重組蛋白AO-801的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及SDS-PAGE和Western-Blot分析

陽性菌落經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h后提取蛋白，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析(圖6)后，在相對分子質(zhì)量約為59 ku處可見特異性反應(yīng)條帶，分子量與預(yù)期值相同。利用鎳柱純化技術(shù)純化重組蛋白酶，經(jīng)SDS-PAGE分析，得到單一條帶，且與預(yù)期大小一致。Western Blot分析(圖7)表明， 表達(dá)的重組蛋白酶能與少孢節(jié)叢孢菌陽性血清發(fā)生特異性血清學(xué)反應(yīng)。

2.5 間接酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，簡稱ELISA)檢測多克隆抗體

用間接ELISA測定抗AO-801多克隆抗體效價。將抗血清稀釋至不同濃度(1 ∶200～1 ∶25 600)，檢測結(jié)果顯示，多克隆抗體效價達(dá)到1 ∶25 600(圖8)。

3 討論

目前國內(nèi)外已有報道表明，少孢節(jié)叢孢菌在侵染線蟲過程中分泌的胞外水解酶(蛋白酶、膠原酶和幾丁質(zhì)酶)在侵入線蟲表皮和降解線蟲細(xì)胞的過程中發(fā)揮著重要作用[2-4]。幾丁質(zhì)是由N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖以β-1，4糖苷鍵連接而成的鏈狀高分子化合物，是含量僅次于纖維素的第二大生物高聚物，也是大多數(shù)線蟲體壁及其蟲卵外殼的主要成分[5]。已有研究表明，許多真菌在其整個生長過程中都會產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，源于致病性真菌的幾丁質(zhì)酶能催化幾丁質(zhì)β-1，4糖苷鍵水解，對真菌侵入線蟲表皮屏障并進(jìn)一步降解宿主細(xì)胞有重要的作用[1，3-5]。

1989年Dackman等在捕食線蟲性真菌培養(yǎng)液中檢測到幾丁質(zhì)酶活性，并發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶的活力水平與致病性密切相關(guān)[6]。近年來，Taib等在煙曲霉中發(fā)現(xiàn)了14個幾丁質(zhì)酶[7]，且煙曲霉YJ-407幾丁質(zhì)酶的晶體結(jié)構(gòu)已有初步研究[8]。此外，Dünkler等在白色念珠菌中發(fā)現(xiàn)4個幾丁質(zhì)酶[9]，在絲狀真菌構(gòu)巢曲霉中發(fā)現(xiàn)了18個幾丁質(zhì)酶，在綠僵菌中發(fā)現(xiàn)了24個幾丁質(zhì)酶[10]，越來越多的有功能的幾丁質(zhì)酶不斷在細(xì)菌、病毒、真菌、植物以及動物等不同生物上被發(fā)現(xiàn)。

本研究中對少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株XJ-A1幾丁質(zhì)酶基因AO-801進(jìn)行了克隆和分子特征分析，發(fā)現(xiàn)AO-801酶屬于糖苷水解酶18家族，也具有類似的結(jié)構(gòu)域，含有幾丁質(zhì)底物結(jié)合位點、水解酶催化活性位點[11-14]，同時還發(fā)現(xiàn)1個幾丁質(zhì)酶插入域(chitinase insertion domain，簡稱CID)。許多GH18中的幾丁質(zhì)酶含有CID，通常CID由5個或5個反平行β-折疊和1個α-螺旋組成，并且其插入TIM桶的第7個α-螺旋和第7個β-折疊之間[15]。CID與TIM桶能夠使幾丁質(zhì)酶和底物牢固結(jié)合，從而更有利于底物的降解。Li等將來自古細(xì)菌、細(xì)菌、真菌、植物和動物的共27個含有幾丁質(zhì)酶插入域的幾丁質(zhì)酶序列進(jìn)行比對和分析，確定了1組高度保守的疏水殘基對幾丁質(zhì)酶的折疊和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性很重要，并推測TIM桶結(jié)構(gòu)域+CID可以通過提供深的底物結(jié)合裂縫來結(jié)合長鏈底物，但是關(guān)于CID在幾丁質(zhì)酶發(fā)揮功能中的作用尚未完全確定[16]。少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO-801存在的TIM桶結(jié)構(gòu)域和CID可能預(yù)示其能更好地與底物結(jié)合，可能在真菌捕食線蟲的過程中發(fā)揮重要作用。此外，Arakane等發(fā)現(xiàn)，高度糖基化的接頭可以保護(hù)幾丁質(zhì)酶免于發(fā)生蛋白水解，而在AO-801中并未發(fā)現(xiàn)存在糖基化位點[17]。

真菌在其整個生長過程中能產(chǎn)生多種幾丁質(zhì)酶，不同真菌幾丁質(zhì)酶的生物學(xué)功能及其在致病過程發(fā)揮的作用也存在差異[18-19]。Arnold等報道的GH18可能參與線蟲的蛻皮以及幼蟲孵化等過程[20-21]。Khan等將擬青霉菌的幾丁質(zhì)酶作用于爪哇根結(jié)線蟲蟲卵，發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶顯著改變了卵殼結(jié)構(gòu)，并且卵黃層被分裂并失去其完整性[22]。少孢節(jié)叢孢菌是新疆地區(qū)分布廣泛的捕食線蟲性真菌，通過對捕食線蟲性真菌胞外水解酶——幾丁質(zhì)酶功能的深入研究將有助于開發(fā)適合新疆地區(qū)的線蟲防控真菌制劑。

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