王凝之 郝建宇

（1揚州大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 江蘇 揚州 225001）

（2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院消化內(nèi)科 北京 100020）

吸煙是一種呈全世界流行的生活習(xí)慣,許多研究表明吸煙是導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)多種疾病的主要危險因素。近年來也有研究發(fā)現(xiàn)吸煙對肝臟功能有所影響。飲酒對肝臟有直接損害。流行病學(xué)研究表明，同時吸煙和飲酒會增加肝臟疾病的風(fēng)險和加重肝臟疾病。

1.實驗材料

1.1 主要實驗試劑及藥物

雄性Wistar大鼠：購于中國人民解放軍軍事科學(xué)院實驗動物中心；中南海香煙：購于北京卷煙廠(焦油量14mg，煙氣煙堿量1.2mg，煙氣一氧化碳量14mg)；牛欄山二鍋頭56°；七氟烷；10%甲醛；PBS磷酸鹽緩沖液：購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；羥脯氨酸檢測試劑盒：購于南京建成生物工程研究所。

1.2 主要實驗儀器

染毒箱；LDZ4-0.8型低速自動平衡微型離心機（中國北京）；Beckman DU-7紫外分光光度計（美國）；MSF-1旋渦混勻器（中國北京）；CF長風(fēng)電熱恒溫水浴箱（中國北京）。

2.動物分組、實驗方法和標本的獲取

2.1 動物分組

采用Wistar雄性大鼠100只，體重200～300g,購自于中國人民解放軍軍事科學(xué)院實驗動物中心。在實驗室常規(guī)飼養(yǎng)，1周后,稱重,平均體重為（226.4±14.7）g。隨機分為4組：吸煙組（n=30），飲酒組（n=30），both組（n=30），對照組（n=10），共計100只。

2.2 實驗方法

A：吸煙組：將大鼠放入80cm×60cm×58cm的有機玻璃制成的染毒箱內(nèi)，在其右上角開一個直徑1cm的通氣孔。每次吸煙16支，每次時長70min ，每天2次，中間間隔4h，連續(xù)12周。

B：飲酒組：用酒灌胃7g/kg，每日兩次，酒精劑量(g)=白酒體積(m1)×白酒體積分數(shù)(0.56)×酒精相對密度(0.8g·ml)，連續(xù)12周。

C：both組：每日吸煙兩次（方法同吸煙組），每日早晚用酒灌胃兩次（方法同飲酒組），連續(xù)12周。

D：對照組：正常飲水、飲食，不作任何處理。

分別在4周、8周、12周將大鼠處死，每個時間點取吸煙組、飲酒組、both組6只大鼠，對照組大鼠于12周與其他組大鼠同時處死。

2.3 標本的留取及處置

實驗當天被處死大鼠不再接受試驗。各時間點前一晚大鼠禁食不禁水。處死大鼠時，予七氟烷吸入性麻醉，取腹壁正中切口打開腹腔，經(jīng)腹主動脈取血以備血AST的測定。將肝臟組織充分暴露，用眼科剪摘取部分肝臟右葉組織。其中取約10×5mm大小肝臟組織固定于10%中性福爾馬林，以便石蠟包埋。

2.4 統(tǒng)計學(xué)的處理

計量資料用X±SD表示，使用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)處理采用方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義，以P＜0.01為差異有顯著性。

3.實驗結(jié)果

3.1 AST結(jié)果

吸煙組、飲酒組、Both組大鼠的血清AST的含量在4周時便出現(xiàn)升高，其中飲酒組大鼠的血清AST的含量在4周時升高幅度明顯高于吸煙組、Both組和對照組，其均數(shù)比較有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.01）。在12周時實驗組和對照組比較均有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（見表1）

表1 AST(U/L)

3.2 羥脯氨酸含量

吸煙組大鼠的肝組織中的羥脯氨酸含量在12周時與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。飲酒組大鼠的肝組織中的羥脯氨酸含量在12周時與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。Both組大鼠的肝組織中的羥脯氨酸含量在12周時明顯高于吸煙組、飲酒組和對照組，其均數(shù)之間有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.05）。（見表2）。

表2 羥脯氨酸（ug/g肝重）

3.3 肝臟組織形態(tài)學(xué)結(jié)果：

取肝臟右葉組織進行HE染色后進行肝臟組織形態(tài)學(xué)改變的評價。對照組大鼠肝臟病理示肝細胞以中央靜脈為中心，呈放射狀排列，具有正常的細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)（見圖1-1）。吸煙組大鼠肝臟組織于12周時有50%（3/6）的大鼠出現(xiàn)了局部形態(tài)學(xué)改變。在這3只大鼠中，主要的病理改變?yōu)楦渭毎[，肝竇間隙變小，并有少量慢性炎性細胞如漿細胞、淋巴細胞浸潤。（見圖1-2）。飲酒組4周、8周的時候無明顯病理改變。在12周時有83.3%（5/6）的大鼠于肝腺泡的3區(qū)(小葉中央靜脈周圍)，出現(xiàn)肝細胞腫大，胞質(zhì)疏松、淡染，有些肝細胞內(nèi)可見小空泡形成?？梢婋p核肝細胞，并可見較多炎性細胞浸潤，但并未出現(xiàn)纖維組織增生等纖維化的病理改變(見圖1-3)。Both組大鼠肝臟組織4周、8周時無明顯改變。12周時亦可見83.3%（5/6）的大鼠小葉中央靜脈周圍，出現(xiàn)肝細胞腫大，胞質(zhì)疏松、淡染，部分肝細胞內(nèi)可見小空泡形成?？梢婋p核肝細胞，炎性細胞浸潤（見圖1-4）。

圖1 HE染色（從左到右，從上到下分別為）：

4.討論

許多研究表明吸煙是導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)多種疾病的主要危險因素。近年來國內(nèi)外也有相關(guān)吸煙對肝臟功能影響的報道。國際癌癥研究機構(gòu)已宣布吸煙是肝癌的一個重要的危險因素。

血清轉(zhuǎn)氨酶是肝細胞損傷的敏感指標[1，2]。本實驗研究結(jié)果顯示被動吸煙后，吸煙組大鼠的血清AST的含量在4周、8周、12周的檢測均有所升高，且明顯高于對照組（P＜0.01）。病理顯示吸煙組大鼠肝臟組織在12周時有50%（3/6）的大鼠出現(xiàn)了病理改變。主要的病理改變?yōu)楦渭毎[，肝竇間隙變小，并有少量慢性炎性細胞如漿細胞、淋巴細胞浸潤。提示了吸煙對肝臟的影響。

羥脯氨酸是一種非必需氨基酸，是膠原代謝的重要產(chǎn)物。Hyp含量的測定已成為衡量機體膠原組織代謝的重要指標，能客觀地反映肝纖維化程度[3，4]，其變化情況不能從血液Hyp的含量中得到體現(xiàn)，而肝組織中Hyp含量可反映肝纖維化的程度和演變過程[2，5]。本實驗研究結(jié)果顯示吸煙組、飲酒組、Both組大鼠肝臟組織內(nèi)的羥脯氨酸含量均隨時間的延長呈增高的趨勢，在12周時均高于對照組，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。其中Both組大鼠肝臟組織內(nèi)羥脯氨酸含量在12周時升高明顯高于吸煙組和飲酒組，其均數(shù)之間有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。提示了肝臟組織膠原含量的增加。

綜上所述，在本實驗中發(fā)現(xiàn)單純被動吸煙后4周時檢測發(fā)現(xiàn)大鼠血清AST的升高，12周時病理可見主要的病理改變?yōu)楦渭毎[，肝竇間隙變小，并有少量慢性炎性細胞如漿細胞、淋巴細胞浸潤。提示了吸煙可引起肝臟損傷。而被動吸煙和飲酒12周后大鼠肝臟組織羥脯氨酸含量升高，病理上出現(xiàn)出現(xiàn)肝細胞變性和炎性細胞浸潤等慢性炎癥表現(xiàn)，因此推測被動吸煙和飲酒可能使導(dǎo)致肝臟組織的慢性炎癥改變，最終可能會導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。

[1] DanilukJ,SzusterCiesielskaA,DrabkoJ,et a1.Serum Cytokine Levels in alcohol-relatedlivercirrhosis.Alcohol 2001;23(1):29-34.

[2] TilgH,JalanR,KaserA,etal.Anti-tumor necrosis factoralpha monoclonal antibody therapy in severe alcoholic hepatitis.JHepatol 2003；38(4)：419-425.

[3] Koda M,Murawaki Y,Hirayama C.Free and small peptidebound hydroxyproline synthesis in rat liver in vitro in CCl4-induced hepatic fibrosis[J].Biochem Biophs Res Commun,1988,151:1128-1135.

[4] Okuno H,Hazama H,Murase T,et al.Drug metabolizing activity in rats with chronic liver injury induced by carbon tetrachloride: Relationship with the content of hydroxyproline in the liver[J].Jpn J Pharmacol,1986,41:363-371.