江若霞 ,趙麗敏

(1.河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校醫(yī)學(xué)系，河南 鄭州 451191；2.河南大學(xué)附屬鄭州市第一人民醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450004)

膽囊癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病的機(jī)制及病因復(fù)雜，診斷困難，但大部分患者在確診時(shí)已處于晚期，手術(shù)的切除率很低[1]。因此，尋找診斷和預(yù)防的方法進(jìn)行早期治療具有重要意義。膜聯(lián)蛋白A1(annexin A1，ANXA1)是鈣離子依賴磷脂蛋白結(jié)合家族中的一員，其具有參與調(diào)控炎性反應(yīng)、凝血過程、鈣離子通道的形成、細(xì)胞的凋亡和分化等多種生物學(xué)功能[2-4]。研究顯示，ANXA1在胃癌、結(jié)腸癌、肝癌等腫瘤中表達(dá)增強(qiáng)，而在前列腺癌、宮頸癌等腫瘤中表達(dá)降低[5-6]，這說明ANXA1在腫瘤的發(fā)生中具有重要影響。鑒于此，本研究通過免疫組化檢測ANXA1在膽囊癌中表達(dá)，研究其對膽囊癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及機(jī)制，以期為膽囊癌的診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料 收集河南大學(xué)附屬鄭州市第一人民醫(yī)院2014年8月至2016年8月期間進(jìn)行膽囊癌切除手術(shù)的患者100例，其中男性40例，女性60例，年齡范圍31～85歲，平均年齡為65.82歲。術(shù)前未行放化療，術(shù)后病理報(bào)告均為腺癌。術(shù)后按照常規(guī)的病理學(xué)檢查確定組織學(xué)類型、腫瘤的分化程度。按照WHO的分級標(biāo)準(zhǔn)分為高(G1，18例)、中(G2，42例)、低(G3，36例)分化組和未分化組(G4，4例)。病理分期按照Nevin標(biāo)準(zhǔn)分為五期，其中0期4例，Ⅰ期23例，Ⅱ期34例，Ⅲ期20例，IV期19例。無淋巴轉(zhuǎn)移41例，有淋巴轉(zhuǎn)移59例。從100例膽囊癌組織臘塊標(biāo)本中隨機(jī)抽取40例，取癌旁組織作為對照組，其中男性15例，女性25例，平均年齡為61.26歲。所有的樣品采集均經(jīng)過患者及其近親屬的知情同意及河南大學(xué)附屬鄭州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

1.1.2細(xì)胞 人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞株購自鄭州大學(xué)。

1.1.3主要試劑和儀器 胎牛血清、胰酶、青鏈霉素均購自美國Gibco公司；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3(Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)、磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3(Phosphorylated Signal transducers and activators of transcription 3,p-STAT3)單克隆抗體及ANXA1多克隆抗體和辣根過氧化物標(biāo)記的二抗均購自美國abcam公司；小干擾RNA-陰性對照(siRNA-NC)組、ANXA1-siRNA購自上海生工生物工程有限公司；DAB顯色試劑盒購自TIANGEN BIOTECH北京有限公司；Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；細(xì)胞計(jì)數(shù)(Cell Counting Kit-8，CCK8)試劑盒購自日本Dongji公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司；酶標(biāo)儀購自TECAN公司；流式細(xì)胞儀購自美國Becton Dickinson公司。

1.2方法

1.2.1免疫組化及結(jié)果判定 將厚度為4 μm的蠟塊切片放置于載玻片上，室溫條件下去除液體，脫蠟過程使用二甲苯，脫水過程使用酒精，在3% 雙氧水條件下孵育20 min后，用0.1%的胰蛋白酶消化反應(yīng)15 min，PH7.4的PBS洗滌3遍，甩去PBS液，加入1∶80稀釋的ANXA1多克隆抗體，孵育70 min，重新清洗3次，加入辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗兔，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ分別浸泡2 min、5 min，中性樹膠封片。PBS作為陰性對照，相應(yīng)抗體的陽性切片作為陽性對照。以O(shè)lympus數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行采集、分析。隨機(jī)選擇10個視野，400倍觀察，測定每個視野下陽性反應(yīng)的平均吸光度值(IOD)，根據(jù)IOD統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞的比例。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 取出保存于液氮罐中的人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞株，置于37 ℃的水浴鍋中溶解，轉(zhuǎn)移溶解的細(xì)胞至一個新的離心管中，向離心管中加入含有10%胎牛血清、100 mg·L-1鏈霉素和1×105U·L-1青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞長滿皿底90%以上時(shí)，0.25%胰酶消化細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基終止消化，按照實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行傳代。細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期再用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將生長至對數(shù)期的人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞株以106個/毫升每孔加2 mL接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明將siRNA-NC(轉(zhuǎn)染對照)、ANXA1-siRNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，各轉(zhuǎn)染100 nmol·L-1，對照組不轉(zhuǎn)染，將各組細(xì)胞與培養(yǎng)基充分混合后加入到人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞，置于37 ℃，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，觀察到細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)，用不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，更換成含血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4轉(zhuǎn)染效果檢測 取生長至對數(shù)期的上述三組細(xì)胞，1 000 r·min-1，離心5 min，加入適量的Trizol置于冰上裂解反應(yīng)30 min后，4 ℃，14 000 r·min-1，離心15 min，吸取蛋白上清液，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒檢測提取的蛋白濃度。將蛋白樣品和上樣緩沖液充分混勻，100 ℃條件下變性5 min，將蛋白加入到SDS-PAGE凝膠孔中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后4 ℃轉(zhuǎn)膜1.5 h，5%的脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，以1∶500稀釋的ANXA1單克隆抗體作為一抗，4 ℃孵育過夜，TBST清洗后加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h，TBST清洗后加入增強(qiáng)型化學(xué)法(ECL)發(fā)光劑顯影，自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以GAPDH作為內(nèi)參，分析蛋白表達(dá)水平。

1.2.5細(xì)胞增殖檢測 將生長至對數(shù)期的上述三組細(xì)胞，以5×103個/毫升每孔100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃，5%二氧化碳濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，向每孔細(xì)胞中加入10 μL CCK8溶液，置于37 ℃，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱孵育3 h，酶標(biāo)儀在波長為490 nm處測定并記錄OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(轉(zhuǎn)染組細(xì)胞OD/對照組細(xì)胞OD)×100%

1.2.6細(xì)胞凋亡檢測 取上述三組細(xì)胞，0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升還有2×105個細(xì)胞，接種細(xì)胞至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h后，取1 mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃，1 000 r·min-1，離心8 min，棄上清，洗滌細(xì)胞后加入200 μL結(jié)合緩沖液，然后加入PI和 Annexin-V各5 μL，室溫避光條件下反應(yīng)20 min后，再加入400 μL結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.7蛋白質(zhì)印跡法檢測STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá) 取上述三組細(xì)胞，按照1.2.4的方法檢測STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。觀測資料中的計(jì)量數(shù)據(jù)，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1ANXA1基因在膽囊癌及癌旁組織中的表達(dá)

ANXA1在膽囊癌中陽性表達(dá)69例，陽性率為69.0%，對照組陽性表達(dá)3例，陽性率為7.5%，兩組之間ANXA1陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 ANXA1基因在膽囊癌及癌旁組織中的表達(dá)/例

注：兩組比較，aχ2=43.261,P<0.01

2.2ANXA1表達(dá)與膽囊癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系如表2所示，ANXA1在膽囊癌中的表達(dá)與性別、年齡不相關(guān)(P>0.05)，與腫瘤的分化程度、臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.01)。

表2 ANXA1表達(dá)與膽囊癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系/例(%)

2.3轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中ANXA1的表達(dá)及對細(xì)胞增殖的影響空脂質(zhì)體、siRNA-NC、ANXA1-siRNA 轉(zhuǎn)染人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞后培養(yǎng)48 h，siRNA-NC組細(xì)胞中ANXA1蛋白表達(dá)率為0.335±0.031，細(xì)胞存活率為(97.02±1.46)%，與對照組[0.342±0.035，(97.15±1.51)%]比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.346)；ANXA1-siRNA組細(xì)胞中ANXA1蛋白表達(dá)率為0.141±0.018，細(xì)胞存活率為(51.54±3.31)%，顯著低于對照組(P=0.003～0.006 )。見圖1。

2.4抑制ANXA1的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測空脂質(zhì)體、siRNA-NC、ANXA1-siRNA 轉(zhuǎn)染人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，siRNA-NC組細(xì)胞凋亡率為(3.42±0.68)%，Cleaved caspase3蛋白表達(dá)率為0.162±0.017，與對照組[(3.35±0.62)%，0.154±0.015]比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.523)；ANXA1-siRNA組細(xì)胞凋亡率為(17.14±2.02)%，Cleaved caspase3蛋白表達(dá)為0.411±0.038，顯著高于對照組(P=0.002～0.005)(圖2)。

注：1為對照組，2為siRNA-NC組，3為ANXA1-siRNA組；與對照組比較，aP=0.002～0.005

2.5抑制ANXA1的表達(dá)對STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)的影響蛋白質(zhì)印跡法檢測上述三組細(xì)胞轉(zhuǎn)染人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞培養(yǎng)48 h后的STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，siRNA-NC組STAT3蛋白表達(dá)率為0.468±0.040，p-STAT3蛋白表達(dá)率為0.220±0.031，與對照組(0.462±0.039，0.216±0.026)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.421)；ANXA1-siRNA組p-STAT3蛋白表達(dá)率為0.094±0.011，顯著低于對照組(P=0.002～0.004)，三個組STAT3蛋白表達(dá)均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.332)(圖3)。

注：1為對照組，2為siRNA-NC組，3為ANXA1-siRNA組；與對照組比較，aP=0.002～0.004

3 討論

膜聯(lián)蛋白超家族有A、B、C、D、E五組，在人類的組織中僅存在A組，A組有13個成員，其中ANXA1是最早發(fā)現(xiàn)的成員。ANXA1屬于胞質(zhì)蛋白，在各種細(xì)胞內(nèi)廣泛存在，占細(xì)胞中蛋白質(zhì)總含量的0.5%～2%，它既可以可溶性的形式存在，也可以穩(wěn)定或可逆的形式結(jié)合在細(xì)胞骨架蛋白上[7-8]。其功能具有多樣性，包括參與炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和分化及信號傳遞等生命活動，在不同腫瘤中的表達(dá)有明顯的差異，且在同一種腫瘤的不同形式中也有可能不同。在不同組織中ANXA1的不同表達(dá)均可引起腫瘤的發(fā)生，目前尚無合理的解釋[9-11]。

注：1為對照組，2為siRNA-NC組，3為ANXA1-siRNA組；與對照組比較，aP=0.003～0.006

本研究中旨在探究ANXA1對膽囊癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及機(jī)制。研究顯示，ANXA1在食管腺癌中高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤的病理分期及淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，ANXA1的表達(dá)越高，腫瘤的分期越高，腫瘤的復(fù)發(fā)率越高[12]。在鼻咽癌中ANXA1低表達(dá)，其表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)[13]。在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)ANXA1表達(dá)越低，腫瘤的惡性程度越高[14]。本研究檢測ANXA1在膽囊癌中的陽性表達(dá)及與病理關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，ANXA1在膽囊癌中的陽性表達(dá)顯著高于相應(yīng)的癌旁組織，且表達(dá)與腫瘤的分化程度、臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。

RNA干擾是一種能引起內(nèi)源性靶基因沉默的機(jī)制，是研究基因功能有效的方法[15]。研究顯示，ANXA1在前列腺癌中高表達(dá)，沉默ANXA1的表達(dá)后能顯著促進(jìn)人前列腺癌細(xì)胞的凋亡[16]。胰腺癌中沉默ANXA1的表達(dá)能阻滯癌細(xì)胞于G1期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。本研究中，檢測沉默ANXA1的表達(dá)對膽囊癌細(xì)胞增殖凋亡的影響，結(jié)果顯示，沉默ANXA1的表達(dá)能顯著抑制人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡和上調(diào)Cleaved caspase3蛋白的表達(dá)。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡過程，主要有半胱氨酸蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng)引起，caspase3處在caspase級聯(lián)反應(yīng)的下游，為細(xì)胞凋亡過程中的共同效應(yīng)蛋白，被稱為“凋亡的執(zhí)行者”[18-19]。本研究的結(jié)果說明沉默ANXA1的表達(dá)，通過上調(diào)Cleaved caspase3蛋白的表達(dá)引起人膽囊癌細(xì)胞的凋亡。

酪氨酸激酶JAK/轉(zhuǎn)錄因子STAT(Janus kinase/Signal transducers and activators of transcription 3,JAK/STAT3)是近些年新發(fā)現(xiàn)的一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，由JAKS蛋白家族和STAT蛋白家族組成，該通路與腫瘤的增殖、分化等生物學(xué)特性密切相關(guān)[20]。STAT3是STAT家族中的一員，參與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等過程，該通路受到細(xì)胞因子、生長因子刺激后，可作用于細(xì)胞核內(nèi)的特異性DNA片段，對靶基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，從而使通路激活，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖異常和惡性轉(zhuǎn)化[21]。本研究中檢測沉默ANXA1的表達(dá)對STAT3信號通路的影響，結(jié)果顯示沉默ANXA1的表達(dá)后能顯著抑制p-STAT3蛋白表達(dá)。

綜上所述，ANXA1基因的表達(dá)參與了膽囊癌的生長、分化和遷移過程，下調(diào) ANXA1的表達(dá)能抑制人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞的增殖，并通過下調(diào)Cleaved caspase3蛋白促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與STAT3信號通路的調(diào)控有關(guān)。該研究為膽囊癌的早期診斷和治療提供了理論依據(jù)。

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