王育，王毅，嚴(yán)亨波，魏譚軍，李霞

(1.達(dá)州市食品藥品檢驗(yàn)所中藥檢測室，四川 達(dá)州 635000；2.達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室，四川 達(dá)州 635000)

理氣散結(jié)顆粒為達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院的醫(yī)院制劑，是經(jīng)白芍、柴胡、延胡索等10味中藥材提取濃縮成稠膏后加入適量輔料制成的顆粒劑。方中白芍柔肝平肝為君藥，配以柴胡、延胡索疏肝解郁，可恢復(fù)肝正常的順達(dá)之性，治療肝郁血瘀之證。為有效控制理氣散結(jié)顆粒的產(chǎn)品質(zhì)量和療效一致性，本文作者采用高效液相色譜(HPLC)波長切換法聯(lián)合梯度洗脫法同時(shí)測定理氣散結(jié)顆粒中的芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿，對理氣散結(jié)顆粒的全面質(zhì)量控制具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 儀器與試藥

1.1儀器島津LC-20AT 高效液相色譜儀(日本島津公司)；XS105DU分析天平(精度：0.01 mg，METTLER TOLEDO公司)；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2試藥與試劑對照品芍藥苷(批號110736-201640，含量95.2%，2～10 ℃冷處保存)、柴胡皂苷a(批號110777-201510，含量93.2%，冷凍保存)、柴胡皂苷d(批號110778-201510，含量97.3%，冷凍保存)、延胡索乙素對照品(批號110726-201617，含量99.8%，2～10 ℃冷處保存)均來源于中國食品藥品檢定研究院；對照品去氫紫堇堿(批號30045-16-0，含量97.5%)來源于成都德思特生物技術(shù)有限公司；對照品紫堇堿(批號518-69-4，含量98.0%)來源于寶雞市辰光生物科技有限公司；理氣散結(jié)顆粒(每袋裝15 g)來源于達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1供試品溶液的制備取本品內(nèi)容物適量，混勻，研細(xì)，取約5.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷至室溫，用70%乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過濾，即得供試品溶液。

2.2對照品溶液的制備分別精密稱取芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿對照品各適量，用70%乙醇制成單一成分對照品儲備溶液(芍藥苷2.878 g·L-1、柴胡皂苷a 0.392 g·L-1、柴胡皂苷d 0.288 g·L-1、延胡索乙素0.272 g·L-1、去氫紫堇堿0.316 g·L-1、紫堇堿0.424 g·L-1)。依次精密量取各對照品儲備液5.0 mL、5.0 mL、5.0 mL、5.0 mL、5.0 mL和2.5 mL，定容至100 mL，用70%乙醇制成混合對照品溶液。

2.3三種陰性樣品溶液的制備依據(jù)理氣散結(jié)顆粒的處方和生產(chǎn)工藝，制備缺白芍陰性樣品、缺柴胡陰性樣品和缺延胡索陰性樣品，依據(jù)供試品溶液制備方法制成白芍陰性樣品溶液、柴胡陰性樣品溶液和延胡索陰性樣品溶液。

2.4色譜條件Agilent TC- C18色譜柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%冰醋酸溶液，梯度洗脫(0～11 min，18.0%A；11～17 min，18.0%A→32.0%A；17～29 min，32.0%A→55.0%A；29～44 min，55.0%A→80.0%A；44～50 min，80.0%A→18.0%A)；0～17 min在230 nm[1-4]波長下檢測芍藥苷，17～29 min在210 nm[5-6]波長下檢測柴胡皂苷a和柴胡皂苷d，29～50 min在280 nm[7-11]波長下檢測延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃。

2.5系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn)取“2.1 供試品溶液”“2.2 對照品溶液”“2.3 三種陰性樣品溶液”和空白溶劑，依法進(jìn)樣測定，記錄色譜峰，各陰性樣品溶液色譜圖中，在所測芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿6種成分對應(yīng)的位置處無干擾(圖1)，理論塔板數(shù)按芍藥苷計(jì)不低于3 500，分離度符合藥典要求。

2.6線性關(guān)系考察精密量取芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿對照品儲備液各0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL，分別置20 mL量瓶中，用70%乙醇定容，制成25倍濃度差的6種不同濃度混合對照品溶液，依法進(jìn)樣測定芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿的峰面積，以芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿的質(zhì)量濃度(mg·L-1)為橫坐標(biāo)(x)，所測各成分的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行線性回歸(表1)。

表1 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7加樣回收率試驗(yàn)分別精密稱取芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿對照品各適量，用70%乙醇制成單一成分的加樣對照品溶液(芍藥苷0.761 g·L-1、柴胡皂苷a 0.539 g·L-1、柴胡皂苷d 0.409 g·L-1、延胡索乙素0.299 g·L-1、去氫紫堇堿0.431 g·L-1、紫堇堿0.247 g·L-1)。

稱取已知含量批號為20160909的理氣散結(jié)顆粒6份，每份約2.5 g，精密稱定，分別精密加入上述各成分對照品溶液5.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、70%乙醇40 mL，按供試品溶液制備方法制備加樣回收樣品溶液，依法進(jìn)樣測定，計(jì)算芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿平均加樣回收率及RSD值(表2)。

2.8精密度試驗(yàn)取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿峰面積的RSD(n=6)分別為0.62%、1.15%、0.72%、0.94%、1.18%和0.55%。

2.9重復(fù)性試驗(yàn)稱取批號為20160909的理氣散結(jié)顆粒6份，按照供試品溶液制備方法制成供試品溶液，依法進(jìn)樣測定，分別計(jì)算芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿的含量，結(jié)果6種組分含量的RSD分別為1.22%、0.89%、1.39%、0.67%、0.43%和1.70%。

2.10穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，分別于室溫下0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、16 h進(jìn)樣測定，結(jié)果供試品溶液室溫下16 h內(nèi)穩(wěn)定，芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿峰面積的RSD分別為1.08%、0.65%、0.82%、0.96%、0.77%和1.31%。

2.11樣品含量測定取3批次樣品，依據(jù)供試品溶液制備方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測定，結(jié)果見表3。

表3 理氣散結(jié)顆粒樣品含量測定結(jié)果/mg·g-1

3 討論

3.1提取方法的選擇在供試品溶液提取方法上，作者分別嘗試了回流提取和超聲提取，結(jié)果回流提取和超聲提取所測6種成分芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿的測定結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，選取操作簡便的超聲提取作為供試品溶液的提取方式；在此實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，作者又考察了不同的超聲提取時(shí)間(15 min、30 min、60 min)和提取溶劑(50%乙醇[1]、70%乙醇[8]、95%乙醇、甲醇[9])，結(jié)果超聲提取15 min所測成分含量測定結(jié)果偏低，超聲提取30 min和超聲提取60 min，所測成分含量較高。以70%乙醇為提取溶劑時(shí)，所測各成分綜合提取率最佳，故最終選取70%乙醇超聲提取30 min作為理氣散結(jié)顆粒供試品溶液的制備方法。

表2 理氣散結(jié)顆粒回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2流動(dòng)相的選擇作者在本研究中分別對甲醇-水流動(dòng)相體系[12]、乙腈-水流動(dòng)相體系[13-14]、乙腈-0.1%磷酸溶液流動(dòng)相體系[9,15-16]、乙腈-0.1%冰醋酸溶液流動(dòng)相體系[6]進(jìn)行了對比考察，以色譜峰基線平穩(wěn)情況和所測成分芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿的峰形及分離度為指標(biāo)，優(yōu)選最佳的流動(dòng)相體系，結(jié)果以乙腈-0.1%冰醋酸溶液為流動(dòng)相按照文中的梯度洗脫進(jìn)行洗脫時(shí)，色譜峰基線平穩(wěn)，所測各成分峰形較好，分離度符合中國藥典規(guī)定。

3.3測定方法的選擇理氣散結(jié)顆粒為中藥復(fù)方制劑，所含成分復(fù)雜，不同活性成分的最大吸收波長差異較大，單一波長難以同時(shí)測定多種活性成分的含量。本研究采用波長切換技術(shù)，提高了所測定成分的靈敏性和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)聯(lián)合梯度洗脫技術(shù)，提高了所測各成分的分離效果，縮短了檢測時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了對理氣散結(jié)顆粒中芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿6種成分的同時(shí)測定。同時(shí)HPLC波長切換聯(lián)合梯度洗脫法對中藥復(fù)方制劑多成分同時(shí)測定存在對照品使用量較大、檢測成本高等不足之處，采用一測多評法對理氣散結(jié)顆粒中多成分同時(shí)測定還在進(jìn)一步研究中。

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