程茹 吳紫潔 張凱 李平 謝體波

摘 要：目的是驗(yàn)證貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公生產(chǎn)的阿維菌素ELISA檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)效果，采用酶聯(lián)免疫法對(duì)雞肉和雞肝樣品中阿維菌素的殘留量進(jìn)行檢測(cè)，并與高效液相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行對(duì)照。結(jié)果顯示，該試劑盒對(duì)兩種樣品的最低檢測(cè)限分別為0.516μg/L、0.609μg/L，試劑盒板內(nèi)板間變異系數(shù)均小于10%；對(duì)兩種樣品做加標(biāo)回收試驗(yàn)，其回收率均在95%～120%之間，變異系數(shù)均小于10%；該方法與儀器檢測(cè)方法檢測(cè)實(shí)際樣品的陰、陽性判斷結(jié)果一致。結(jié)論為該方法穩(wěn)定、可靠，可滿足食品中阿維菌素殘留快速檢測(cè)的需要。

關(guān)鍵詞：酶聯(lián)免疫 阿維菌素 檢測(cè) 雞肉 試劑盒

阿維菌素類藥物是一種被廣泛使用的農(nóng)用或獸用殺菌、殺蟲、殺螨劑，屬于大環(huán)內(nèi)脂類抗生素，其作為一種抗寄生蟲藥物而被廣泛應(yīng)用。劉耀川等人對(duì)阿維菌素的組成、化學(xué)結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制、不良反應(yīng)等基礎(chǔ)性質(zhì)進(jìn)行了研究[ 1 ]。作為一種毒性化合物，阿維菌素類藥物在動(dòng)植物中的危害也逐漸得到重視，當(dāng)前主要的檢測(cè)手段有微生物法、儀器檢測(cè)法、免疫分析法等[ 2 - 6 ]。由于儀器分析法的樣本前處理及測(cè)定操作繁瑣且費(fèi)用高，其推廣使用受到限制；而微生物法也存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、檢測(cè)精度低等缺陷。酶聯(lián)免疫法可彌補(bǔ)以上兩種方法存在的缺陷，兼具操作便捷、精度高、經(jīng)濟(jì)、可批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。

本實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫法對(duì)雞肉、雞肝中阿維菌素類藥物的檢測(cè)效果進(jìn)行研究，并對(duì)比儀器檢測(cè)結(jié)果以進(jìn)一步驗(yàn)證公司自主研究的阿維菌素ELISA試劑盒的檢測(cè)效果，從而為雞肉的快速、精準(zhǔn)檢測(cè)提供高效的檢測(cè)途徑。

1材料及設(shè)備

材料：阿維菌素ELISA檢測(cè)試劑盒（自主研發(fā)），其中含有：96孔酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品6瓶（0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L，1mL/瓶）、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品（1μg/mL，1mL/瓶）、酶標(biāo)二抗、抗體工作液、底物A液、底物B液、終止液、20×濃縮洗滌液、2×濃縮復(fù)溶液；雞肉、雞肝樣品（市售，購自貴陽小河沃爾瑪超市）；甲醇（分析純）、乙腈（分析純）、無水硫酸鈉（分析純）、sep-pak vac12cc（2g）柱（組織樣本方法-使用）、堿性氧化鋁（100～200目，分析純）、正己烷（分析純）、去離子水。

設(shè)備：微孔板酶標(biāo)儀（450/630nm）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮?dú)獯蹈裳b置、均質(zhì)器、振蕩器、渦旋儀、離心機(jī)、天平（感量0.01g）、刻度移液管（10mL）、聚苯乙烯離心管（2mL、50mL）、玻璃試管（10mL）、微量移液器（單道：20～200μL、100～1000μL，多道：250μL）。

2 方法

2.1 溶液配制

配液1：復(fù)溶工作液。用去離子水將2×濃縮復(fù)溶液按1：1體積比例進(jìn)行稀釋（1份2×濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于樣本的復(fù)溶工作液在4℃環(huán)境中可保存一個(gè)月。

配液2：洗滌工作液。用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19的體積比進(jìn)行稀釋（1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水）用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4℃環(huán)境中可保存一個(gè)月。

2.2 樣本前處理

將雞肉、雞肝切碎后用均質(zhì)器均質(zhì)，稱取5.0±0.05g均質(zhì)后的樣本至50mL聚苯乙烯離心管中，加入10mL甲醇，渦旋儀渦動(dòng)1min，再用振蕩器震蕩，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min；移取20μL上清液至2mL聚苯乙烯離心管中，加入復(fù)溶工作液，按1：9體積比進(jìn)行稀釋（20μL樣本+18μL復(fù)溶工作液）；取20μL用于分析。

2.3 試驗(yàn)步驟

①將所有試劑取出回溫，使用前搖勻。

②取出所需數(shù)量的微孔板。

③編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2個(gè)平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在位置。

④加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本和抗體工作液：加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20μL至對(duì)應(yīng)微孔中，然后加抗體工作液80μL/孔，輕輕震蕩混勻，用蓋板膜蓋板后，置于37℃環(huán)境下避光反應(yīng)30min。

⑤洗板：揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加入洗滌工作液250μL/孔，充分洗滌4～5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干。

⑥加酶標(biāo)二抗：加入酶標(biāo)二抗100μL/孔，輕輕震蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光反應(yīng)30min，取出后重復(fù)洗板步驟。

⑦顯色：加入底物液A液50μL/孔，再加入底物液B液50μL/孔，輕輕震蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置于37℃避光顯色15min。

⑧測(cè)定：加入終止液50μL/孔，輕輕震蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定OD值。

2.4 阿維菌素濃度的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)品或樣品百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣品吸光度值的平均值除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品（0μg/L）吸光度值的平均值，再乘以100%，即百分吸光率（%）=B/B0×100%（B為標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液的平均吸光度值，B0為0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值）。

將樣品的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品所對(duì)應(yīng)濃度，乘以其對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)即為樣品中阿維菌素實(shí)際濃度。

2.5 試劑盒相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)方法

分別對(duì)試劑盒的靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度進(jìn)行試驗(yàn)，并將靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度與HPLC檢測(cè)的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行對(duì)比。

2.5.1 試劑盒靈敏度測(cè)定方法

分別對(duì)20份空白雞肉、雞肝樣品進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算阿維菌素濃度，以20份品中阿維菌素濃度的平均值（ ）和標(biāo)準(zhǔn)差（S）來表示檢測(cè)限（LOD），即：

式中：X為實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定空白樣品的平均值；n為實(shí)驗(yàn)測(cè)定樣品的數(shù)量。

2.5.2 試劑盒精密度測(cè)定方法

取10個(gè)試劑盒，每盒隨機(jī)取1塊酶標(biāo)板，每塊酶標(biāo)板中隨機(jī)抽取20個(gè)微孔，測(cè)定4.5μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，計(jì)算變異系數(shù)。

2.5.3 樣品準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定方法

向空白樣品中加入阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品，使雞肉中阿維菌素終濃度為10、20、30μg/L，雞肝中阿維菌素終濃度為15、25、35μg/L，每種樣品、每個(gè)濃度均做5個(gè)平行，按2.4操作方法進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算板內(nèi)、板間變異系數(shù)及回收率。

2.6 儀器測(cè)定方法

參照國標(biāo)GB/T 23200.20-2016[ 7 ]。

3 結(jié)果分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L，分別測(cè)得其吸光度值為2.043、1.362、0.997、0.683、0.346、0.055，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=-33.49X+55.58，R2=0.998。

3.2 試劑盒靈敏度測(cè)定結(jié)果

參按照2.4的方法，得到阿維菌素試劑盒檢測(cè)雞肉、雞肝樣品的檢測(cè)限如表1，可知，該試劑盒對(duì)雞肉、雞肝幾種樣品的最低檢測(cè)限分別為0.516μg/L、0.609μg/L，遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)中雞肉和雞肝產(chǎn)品中0.01μg/mL的最低限量要求。

3.3 試劑盒精密度測(cè)定結(jié)果

由表2可知，阿維菌素試劑盒的板內(nèi)、板間變異系數(shù)在5%～8%之間，均小于10%，說明該試劑盒重現(xiàn)性好，性能較為穩(wěn)定。

3.4 試劑盒準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果

向雞肉、雞肝兩種空白樣品中分別添加不同濃度的阿維菌素，每個(gè)濃度各5個(gè)平行，同時(shí)做空白對(duì)照，按2.4操作方法測(cè)定。分別計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差及回收率，從表3可知，4種樣品回收率均在95%～120%之間，變異系數(shù)均小于10%，符合《農(nóng)業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]17號(hào)附件2中試劑盒備案參考證券標(biāo)準(zhǔn)中第4點(diǎn)關(guān)于精密度和準(zhǔn)確度的規(guī)定，說明該阿維菌素檢測(cè)試劑盒精密度良好。

3.5 與儀器對(duì)比測(cè)定結(jié)果

3.5.1 靈敏度比較

隨機(jī)抽取市售雞肉和雞肝樣品各5份，分別用ELISA試劑盒和高效液相色譜測(cè)定樣品中阿維菌素的殘留量，由表4可知，ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果與儀器檢測(cè)結(jié)果復(fù)核率為100%，說明ELISA檢測(cè)試劑盒靈敏度較高；檢測(cè)的20個(gè)樣品中三聚氰胺殘留量均未超標(biāo)，合格率達(dá)到100%，說明相關(guān)部門已經(jīng)加大對(duì)食品安全監(jiān)管力度，違法現(xiàn)象大大減少，保障了人民食品安全和健康。

3.5.2 準(zhǔn)確度和精密度比較

在同等條件下，對(duì)空白雞肉樣品做阿維菌素添加量為20μg/L的添加回收試驗(yàn)（其中，ELISA試劑盒檢測(cè)方法中，隨機(jī)選取3塊酶標(biāo)板，每塊板做4個(gè)平行），比較ELISA試劑盒和高效液相色譜法回收率和變異系數(shù)。由表5可知，儀器檢測(cè)方法的回收率在96.78%～105.38%，平均回收率為99.32%，變異系數(shù)為4.12%；兩次平行試驗(yàn)，ELISA試劑盒的回收率在97.78%～109.98%之間，平均回收率為102.19%，試劑盒板間變異系數(shù)為3.74%；ELISA法和HPLC法測(cè)定結(jié)果基本一致，符合度基本達(dá)到100%，適用于雞肉中阿維菌素的殘留檢測(cè)。

4 結(jié)論

本研究采用酶聯(lián)免疫法對(duì)雞肉、雞肝中阿維菌素殘留量進(jìn)行檢測(cè)，通過與儀器檢測(cè)方法做對(duì)照，驗(yàn)證本公司自主研發(fā)的阿維菌素ELISA檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)效果。結(jié)果表明，阿維菌素ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)靈敏度較高，對(duì)雞肉、雞肝樣品最低檢測(cè)限較低，遠(yuǎn)低于國家規(guī)定最高殘留量；與高效液相-質(zhì)譜檢測(cè)法相比，檢測(cè)結(jié)果一致，且試劑盒檢測(cè)用時(shí)短（30min）、樣品前處理方法簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)單、投入少、耗能低，可滿足對(duì)雞肉等樣品中殘留阿維菌素的快速檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉耀川，趙剛，寧靜等.阿維菌素的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2012（01）：60-62.

[2] 鄭嵐，王梅，段勁升等.阿維菌素類農(nóng)藥的殘留研究綜述[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011（11）：169-170.

[3] 王海，劉素英，單吉浩等.液相色譜法測(cè)定豬組織中阿維菌素類藥物殘留量[J].中國獸藥雜志，2005，39（9）12-15.

[4] 周俊，喬坤云，馮婷等.牛豬肉中伊維菌素殘留量的HPLC檢測(cè)與分析[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器，2005，（1）82-83.

[5] 高國文.高效液相色譜法檢測(cè)大白菜中阿維菌素殘留量，農(nóng)藥科學(xué)與管理，2005，26（11）：8-9.

[6] 張少華，皇甫偉國，何新華等.高效液相色譜法檢測(cè)蔥中阿維菌素的殘留量，藥，2006，45（4）：362-364.

[7] GB 23200.20-2016食品中阿維菌素殘留量的測(cè)定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法.

基金項(xiàng)目：2017年貴州省工業(yè)和信息化發(fā)展專項(xiàng)資金計(jì)劃（項(xiàng)目名稱：技術(shù)中心創(chuàng)新能力建設(shè)（2017002））；2016年貴陽市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目名稱：磺胺類、阿維菌素類藥物快速檢測(cè)實(shí)際開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化）；2016年貴州省技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目（項(xiàng)目名稱：慢抗快速檢測(cè)試劑盒產(chǎn)業(yè)化）；2016年貴州省科技廳社會(huì)攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：黔科合[2016]支撐2908號(hào)）、2017年貴州省科技支撐項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：黔科合支撐[2017]2034）、貴陽市2016年人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：筑人才辦合同字[2016]第13號(hào)）。