陳苛蒙，金黎明，包艷春，王曉彤，孫 怡，胡文忠(大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連 116605)

核桃楸(JuglansmandshuricaMaxim)為胡桃科胡桃屬落葉喬木，根、皮、葉和種子都有一定的藥用價值，其中對核桃楸皮(bark ofJuglansmandshuricaMaxim)的研究和應(yīng)用最多。核桃楸皮是核桃楸的樹皮，幾乎無氣味，味道略微苦澀，有清熱解毒、止痢、明目的功能，可用于治療細菌性痢疾、骨結(jié)核、麥粒腫等疾病[1-2]，民間偏方也有用其水煎劑治療乳腺炎、肝炎、腫瘤等[3-4]。已知核桃楸皮中含有較多的活性物質(zhì)，主要有胡桃醌、黃酮類、生物堿、二芳基庚酸類化合物、甙類化合物、鞣質(zhì)類化合物、萘醌及其衍生物等[5-7]，在這些活性物質(zhì)中，人們只對胡桃醌的研究較多，且一般集中在抗氧化、消炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等方面[8-10]，而對核桃楸皮抑菌性能的研究較少。

本實驗研究了核桃楸皮提取物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌、弧菌、白色念珠菌5種致病菌的抑菌性能，對核桃楸皮活性成分的功能研究進一步補充了數(shù)據(jù)，也為開發(fā)抗菌藥物奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料與試劑

核桃楸皮，遼寧丹東藥業(yè)有限公司提供。清洗核桃楸皮并剪碎，于陰涼干燥處自然風(fēng)干，置于櫥柜中避光保存待用。

乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇等，國產(chǎn)優(yōu)級純試劑。

1.1.2 指示菌與培養(yǎng)基

指示菌：弧菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和白色念珠菌，實驗室保藏菌。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH約為7.0。

1.1.3 儀器與設(shè)備

BSA224S電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；DHG-9070A電熱恒溫干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；MT-180B生化恒溫培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；KQ5200E超聲波雙頻清洗機(寧波新枝生物科技股份有限公司)；HVE-50高壓滅菌器(日本HIRAYAMA)；ZWY-A2102C雙層可編程恒溫搖床(上海智誠分析儀器制造有限公司)；G80F23CN1P-G5(S0)微波爐(格蘭仕微波爐電器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 核桃楸皮活性物質(zhì)的提取

(1)核桃楸皮的乙醇提取。稱取一定量核桃楸皮，應(yīng)用超聲波提取法提取核桃楸皮中的活性物質(zhì)。工藝參數(shù)為：料液比1:8(g·mL-1)，乙醇體積分數(shù)95%，浸提溫度35 ℃，作用時間30 min。收集提取液，提取容器中重新加入8倍量的溶劑進行提取，重復(fù)3次，將得到的抽提液合并進行減壓抽濾，除去不溶性雜質(zhì)，35 ℃下將濾液減壓蒸餾，得到黑褐色膏狀物。

稱取一定量膏狀物，用70%乙醇配制成3個濃度梯度，分別為50、5、0.5 mg·mL-1，并做好標記，保存待用。

(2)核桃楸皮的萃取。稱取一定量的上述膏狀物，加入適量去離子水，超聲波振蕩，使其形成分布均勻的懸浮液，依次使用適量的石油醚、氯仿、乙酸乙酯進行萃取，每種有機溶劑各萃取3次。將各相萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃下真空濃縮，分別得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相及水相物質(zhì)[11]。

用甲醇溶解各有機相物質(zhì)，并配制成3個濃度梯度，分別為50、5、0.5 mg·mL-1，水相物質(zhì)使用超純水配制成相同的濃度，留存待用。

1.2.2 抑菌活性測定

采用瓊脂平板打孔法測試核桃楸皮提取物的抑菌活性[12]。

LB培養(yǎng)基融化后，室溫放置溫度至40 ℃左右，接入供試菌種，倒平板，待培養(yǎng)基凝固后，用打孔器在平板內(nèi)的培養(yǎng)基上打4個孔，分別注入3個濃度的核桃楸皮提取物溶液各200 μL，對照孔加入200 μL相對應(yīng)的溶劑。

將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱內(nèi)，37 ℃條件下培養(yǎng)12 h，觀察抑菌圈的大小并測量抑菌圈的直徑，做好記錄。對所得結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇提取物的抑菌結(jié)果

乙醇提取物的抑菌效果如圖1，其中標號1～3分別為50、5、0.5 mg·mL-1的乙醇提取物，標號4為70%乙醇的對照。乙醇提取物對5種致病菌均有抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，濃度為50 mg·mL-1時(若無提示以下均默認此濃度)抑菌圈直徑為22.05 mm，對白色念珠菌的抑制效果最差，抑菌圈直徑為10.50 mm。

(a)副溶血弧菌 (b)金黃色葡萄球菌 (c)大腸埃希氏菌 (d)鼠傷寒沙門氏菌 (e)白色念珠菌

2.2 萃取物抑菌結(jié)果

2.2.1 石油醚萃取物抑菌結(jié)果

石油醚萃取物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到的浸膏有一部分不溶于甲醇，將這部分物質(zhì)使用石油醚溶解后做抑菌實驗，發(fā)現(xiàn)這些不溶于甲醇的物質(zhì)對5種致病菌都無抑菌活性，故對實驗結(jié)果無影響。其中溶于甲醇的物質(zhì)只對金黃色葡萄球菌和弧菌有抑制作用，且對弧菌的抑制效果較好，抑菌圈直徑達到22.69 mm，如圖2(1～3分別為50、5、0.5 mg·mL-1的石油醚萃取物，4為甲醇對照)。

(a)副溶血弧菌 (b)金黃色葡萄球菌 (c)大腸埃希氏菌 (d)鼠傷寒沙門氏菌 (e)白色念珠菌

2.2.2 氯仿萃取物抑菌結(jié)果

氯仿萃取物的抑菌效果如圖3(1～3分別為50、5、0.5 mg·mL-1的氯仿萃取物，4為甲醇對照)。氯仿萃取物對金黃色葡萄球菌、弧菌和白色念珠菌有抑制作用，對金黃色葡萄球菌抑制作用最好，抑菌圈直徑為27.34 mm，對白色念珠菌的抑菌圈直徑為14.30 mm。

(a)副溶血弧菌 (b)金黃色葡萄球菌 (c)大腸埃希氏菌 (d)鼠傷寒沙門氏菌 (e)白色念珠菌

2.2.3 乙酸乙酯萃取物抑菌結(jié)果

乙酸乙酯萃取物對5種致病菌均有抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌的抑制作用最好，抑菌圈直徑為26.25 mm，如圖4(1～3分別為50、5、0.5 mg·mL-1的乙酸乙酯萃取物，4為甲醇對照)。

(a)副溶血弧菌 (b)金黃色葡萄球菌 (c)大腸埃希氏菌 (d)鼠傷寒沙門氏菌 (e)白色念珠菌

2.2.4 水相物質(zhì)抑菌結(jié)果

剩余的水相中物質(zhì)只對金黃色葡萄球菌有抑制效果，對其他4種致病菌無抑菌活性，實驗結(jié)果如圖5(1～3分別為50、5、0.5 mg·mL-1的水相物質(zhì)，4為超純水對照)。

(a)副溶血弧菌 (b)金黃色葡萄球菌 (c)大腸埃希氏菌 (d)鼠傷寒沙門氏菌 (e)白色念珠菌

2.3 分析與討論

萃取物質(zhì)對致病菌抑制作用的標準按照中國藥品生物制品鑒定所、衛(wèi)生部抗菌藥物細菌耐藥性檢測中心制定的《抗菌藥物藥敏試驗判斷標準》進行判定，即抑菌圈20 mm以上為極度敏感，15～20 mm為高度敏感，10～15 mm為中度敏感，10 mm以下為低度敏感。實驗結(jié)果匯總見表1。

表1 實驗結(jié)果匯總

注：打孔器直徑9 mm

乙醇提取物對5種致病菌都有抑制作用，且對副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果最好(5 mg·mL-1的濃度即對其有抑菌作用)。濃度為50 mg·mL-1時對金黃色葡萄菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌為極度敏感，對副溶血弧菌為高度敏感，對白色念珠菌為中度敏感，此結(jié)果為后續(xù)分離萃取提供了實驗基礎(chǔ)。

對于同一液相萃取物，石油醚相物質(zhì)的最大濃度50 mg·mL-1對弧菌為極度敏感，對金黃色葡萄球菌為高度敏感，對其他3種致病菌均無影響；氯仿相物質(zhì)的最大濃度對弧菌和金黃色葡萄球菌極度敏感，另外其對真菌中度敏感；乙酸乙酯相對5種致病菌都有抑制效果，其中對金黃色葡萄球菌極度敏感；剩余的水相中含有的活性物質(zhì)極少，只對金黃色葡萄球菌極度敏感。

對于不同萃取相來說，對弧菌和金黃色葡萄球菌抑制效果最好的是氯仿相，但是萃取活性物質(zhì)種類最多的是乙酸乙酯相。

袁海艦[11]對核桃楸皮中的活性物質(zhì)進行了提取與分析，結(jié)果表明，核桃楸皮的乙醇提取物、氯仿相和乙酸乙酯相是核桃楸皮中抑菌活性成分的富集組分，與本實驗的結(jié)果較為一致。

3 結(jié) 論

本研究對核桃楸皮活性成分功能的進一步分析補充了數(shù)據(jù)，也為開發(fā)抗菌藥物奠定了一定的基礎(chǔ)。核桃楸皮經(jīng)乙醇提取后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，采用瓊脂擴散法測試其對5種致病菌的抑菌活性。結(jié)果表明，乙醇和乙酸乙酯萃取物對5種致病菌都有抑制作用；石油醚萃取物只對弧菌和金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用，50 mg·mL-1濃度下的抑菌圈直徑分別為22.69 mm和16.58 mm；氯仿萃取物對弧菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌有抑制作用，50 mg·mL-1濃度下的抑菌圈直徑分別為25.01 mm和27.34 mm。具體不同萃取相中的活性物質(zhì)成分有待于進一步的探索。

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