王啟明,周蘇娜,邵秋菊,常 浩,梁 軍*,許家玲

(1空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院放射治療科,西安 710038;2西安市胸科醫(yī)院腫瘤科；*通訊作者,E-mail:liangjun1964@126.com)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer)是最常見的惡性腫瘤之一,全球每年結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)多達(dá)100萬(wàn)以上,每年超過(guò)50萬(wàn)人死于該疾病[1]。近年來(lái),雖然結(jié)直腸癌化療藥物和靶向治療選擇較多,但仍有30%-40%患者常規(guī)治療無(wú)效[2]。進(jìn)一步探索新的治療靶點(diǎn)成為下一步研究熱點(diǎn)。

人類表皮生長(zhǎng)因子受體Ⅱ(Her-2)和Ki67作為增殖等重要標(biāo)記物[3,4],在腸癌中的相互表達(dá)關(guān)系及其臨床意義鮮有報(bào)道。本研究擬采用免疫組化的方法檢測(cè)兩者在結(jié)直腸癌組織中的蛋白水平表達(dá)情況及與患者臨床病理特征、臨床預(yù)后的關(guān)系,為結(jié)直腸癌患者的個(gè)體化治療找到潛在的新靶點(diǎn),為臨床診斷和治療提供幫助。

準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)估計(jì)患者癌癥特異性死亡率可以協(xié)助臨床醫(yī)生為結(jié)直腸癌患者選擇輔助治療方案和制訂隨訪計(jì)劃。決策曲線分析(decision curve analysis,DCA)在這樣的臨床需求下運(yùn)用而生[5],目前在前列腺癌等研究中運(yùn)用較多[6],而在結(jié)直腸癌研究中運(yùn)用較少,本研究擬采用決策曲線分析臨床病理中常用的兩個(gè)標(biāo)記Her-2、Ki-67在結(jié)腸癌患者的臨床運(yùn)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取第四軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院2007-06-01～2012-12-30經(jīng)手術(shù)切除的結(jié)直腸癌標(biāo)本228例,男性120例,女性108例,平均年齡58歲(年齡范圍:25-84歲)。根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn),病理學(xué)為腺癌188例,黏液腺癌33例,7例為印戒細(xì)胞癌等其他類型。病理組織學(xué)分級(jí):高分化癌78例,中分化癌124例,低分化癌26例。大體類型:潰瘍型76例,隆起型33例,浸潤(rùn)型18例;80例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,148例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移28例,均為可手術(shù)切除的肝轉(zhuǎn)移灶、肺轉(zhuǎn)移灶。

術(shù)前臨床診斷低位cT3(距離肛緣小于5 cm)或N1的直腸癌患者接受新輔助放化療;術(shù)后病理確診為Ⅲ、Ⅳ期的病例,接受改良FOLFOX6方案輔助性化療,并按術(shù)后常規(guī)定期隨訪,術(shù)后隨訪8-82個(gè)月(中位隨訪時(shí)間44個(gè)月)。本研究隨訪的終點(diǎn)事件是死亡,隨訪截止日期為2016年11月30日。

1.2 免疫組化染色

鼠抗人Ki-67單克隆抗體、鼠抗人Her-2單克隆抗體,DAB顯色試劑盒、SP試劑盒,均購(gòu)自北京中山生物公司。采用SP法,具體步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行。采用已知典型陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照,用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。Her-2以細(xì)胞膜、細(xì)胞漿呈棕黃色為免疫組化陽(yáng)性,Ki-67以腫瘤細(xì)胞核呈棕褐色為免疫組化陽(yáng)性。隨機(jī)選擇10個(gè)×400視野,每個(gè)視野至少計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞,陽(yáng)性細(xì)胞百分比>10%定為陽(yáng)性,≤10%為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件包,其中計(jì)數(shù)資料用構(gòu)成比表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn),相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單因素生存分析采用Kaplan-Meier log-rank法檢驗(yàn)差異,Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素采用stepwise Backward: LR方法。采用R語(yǔ)言3.4.2版本Decision curve包進(jìn)行決策曲線分析。

2 結(jié)果

2.1 Her-2和Ki-67表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

228例結(jié)直腸癌中Her-2陽(yáng)性表達(dá)為109例,表達(dá)率為47.8%,其免疫化學(xué)染色結(jié)果見圖1A。Her-2陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)分期(N分期)有關(guān)(P=0.002),而與患者性別、年齡、腫瘤大體類型、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05,見表1)。而228例結(jié)直腸癌中Ki-67陽(yáng)性表達(dá)為147例,表達(dá)率為64.5%,其陽(yáng)性表達(dá)見圖1B。Ki-67的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度(T分期)有關(guān)(P=0.014),與患者性別、年齡及病理類型、腫瘤分化程度等無(wú)關(guān)(P>0.05,見表1)。

A. Her-2 B. Ki-67圖1 Her-2和Ki-67蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá) (免疫組織化學(xué),×400)Figure 1 Expression of Her-2 and Ki-67 in colorectal cancer patients (IHC,×400)

2.2 結(jié)直腸癌組中Ki-67與Her-2表達(dá)的相關(guān)性

采用Spearman相關(guān)性分析,Her-2和Ki-67蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=0.228,P=0.115)。

2.3 結(jié)直腸癌組中Ki-67和Her-2表達(dá)的臨床意義

結(jié)合臨床隨訪資料,Kaplan-Meier分析顯示Her-2和Ki-67是結(jié)直腸癌的預(yù)后因素(見圖2A,2B)。Her-2陽(yáng)性表達(dá)者預(yù)后欠佳(風(fēng)險(xiǎn)比2.397,95%置信區(qū)間1.515-3.791,χ2=13.94,P<0.001),Ki-67陽(yáng)性表達(dá)者預(yù)后欠佳(風(fēng)險(xiǎn)比2.344,95%置信區(qū)間1.477-3.723,χ2=17.81,P=0.001)。進(jìn)一步采用Cox Stepwise Backward LR方法篩選獨(dú)立預(yù)后因素,分析顯示Her-2和Ki-67仍是獨(dú)立預(yù)后預(yù)測(cè)因素(見表2)。

本研究發(fā)現(xiàn)Her-2和Ki-67是腸癌獨(dú)立預(yù)后因素,進(jìn)一步采用決策曲線分析顯示,聯(lián)合Her-2、Ki-67和TNM的預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)結(jié)果優(yōu)于單純TNM分期系統(tǒng)和單純Her-2檢測(cè)、單純Ki-67檢測(cè)結(jié)果,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.023,0.002,0.001,見圖3)。

表1Her-2、Ki-67表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

Table1AssociationofexpressionofHer-2andKi-67withclinic-pathologicalfactorsforcolorectalpatients.

圖2 Kaplan-Meier分析Her-2和Ki-67表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床預(yù)后關(guān)系Figure 2 Kaplan-Meier curves of relationship between expression of Her-2 and Ki-67 with prognosis in colorectal cancer patients

表2多因素分析結(jié)直腸癌患者獨(dú)立預(yù)后因素

Table2Coxmultivariateanalysisofsurvivalfactorsforcolorectalcancerpatients

臨床病理特征風(fēng)險(xiǎn)比95%置信區(qū)間PKi-67(陽(yáng)性:陰性)3.1291.720—5.691<0.001Her-2(陽(yáng)性:陰性)1.9161.126—3.2600.016T分期(T3-4:T1-2)1.6751.174—2.3910.004N分期(N2:N1:N0)1.5651.139—2.1510.006M分期(M1:M0)2.4081.393-4.1650.001

圖3 決策曲線分析Her-2、Ki-67、TNM以及三者組合的預(yù)測(cè)模型Figure 3 Decision curve of four predictive models based on Her-2, Ki-67, TNM staging, and combination of three markers

3 討論

Her-2又稱c-erbB-2,定位于17q21,其編碼蛋白屬于跨膜蛋白的酪氨酸激酶Ⅱ型受體家族一員。與EGFR、Her-3或胞外配體等二聚化后的Her-2通過(guò)PI3K、MAPK、PLCγ等途徑影響下游信號(hào)通路[7];Her-2也可以通過(guò)自身攜帶的磷酸化位點(diǎn),激活特定信號(hào)蛋白,導(dǎo)致細(xì)胞增殖、逃逸凋亡等,進(jìn)而誘發(fā)腫瘤[8]。病理狀態(tài)下,Her-2位于細(xì)胞表面,是靶向治療的良好靶標(biāo)。人源化抗Her-2抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)已被批準(zhǔn)用于Her-2過(guò)表達(dá)的乳腺癌和晚期胃癌患者。因此檢測(cè)Her-2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)具有確切臨床價(jià)值。

Her-2的表達(dá)與結(jié)直腸癌表達(dá)及其臨床意義,國(guó)內(nèi)外的報(bào)道結(jié)論并不一致。本研究發(fā)現(xiàn)Her-2陽(yáng)性表達(dá)率47.8%,與既往文獻(xiàn)報(bào)道相似[9,10]。蔡三軍教授團(tuán)隊(duì)Lu等[11]發(fā)現(xiàn)Her-2等表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),并與預(yù)后相關(guān)。而Chen等[12]研究發(fā)現(xiàn)Her-2表達(dá)與腸癌預(yù)后無(wú)關(guān)。本研究顯示:在結(jié)直腸癌中,Her-2陽(yáng)性表達(dá)的升高與結(jié)直腸癌分化程度顯著相關(guān),低分化的結(jié)直腸癌Her-2陽(yáng)性率明顯高于中高分化結(jié)直腸癌,表明Her-2與結(jié)直腸癌的惡性程度有關(guān)。但本研究發(fā)現(xiàn)Her-2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),這一結(jié)論與蔡三軍教授團(tuán)隊(duì)結(jié)果[11]不完全相同。不同研究結(jié)果的差異,可能是由于樣本量不同、所選取的病例腫瘤分期等差異造成的。盡管有上述不同的結(jié)論,但多數(shù)研究?jī)A向于Her-2與結(jié)直腸癌腫瘤惡性生物學(xué)特征相關(guān),并與不良預(yù)后相關(guān)[13]。本研究顯示Her-2過(guò)表達(dá)于腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者,也提示這一部分患者是曲妥珠單抗?jié)撛谥委熑巳?。另?可與EGFR結(jié)合而二聚化的Her-2,其過(guò)表達(dá)后干預(yù)EGFR的降解,進(jìn)而影響抗EGFR靶向治療作用[14]。因此曲妥珠單抗在腸癌的治療作用值得進(jìn)一步探索。令人驚喜的是,目前國(guó)外已有Her-2在結(jié)直腸癌中治療的前瞻性Ⅱ期臨床研究,具有一定的療效和較好的耐受性[15],有待國(guó)際多中心的Ⅲ期臨床研究等高級(jí)別資料進(jìn)一步證實(shí)。

Ki-67首先于1991年被發(fā)現(xiàn),基因位于10q25,其編碼蛋白是人增生細(xì)胞核中普遍存在、與增殖相關(guān)的標(biāo)志性核蛋白,與細(xì)胞周期密切相連,在除了G0期之外的G1、S、G2、M細(xì)胞周期均有表達(dá)[16],故認(rèn)為Ki-67可作為檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)之一。本研究表明,Ki-67表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度正相關(guān),提示Ki-67與結(jié)直腸癌惡性程度密切相關(guān)。Ki-67在乳腺癌等腫瘤研究較多[17],而在結(jié)直腸癌中的臨床價(jià)值研究相對(duì)較少。本研究的結(jié)果,將進(jìn)一步明確Ki-67在結(jié)直腸癌中臨床價(jià)值。另一方面,Ki-67在大部分惡性腫瘤中表達(dá)增加[18],雖然其表達(dá)特異性欠佳,但其表達(dá)陽(yáng)性率較高,敏感性高,提示該指標(biāo)可以為監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供參考價(jià)值。雖然本研究從蛋白水平探討了Her-2與Ki-67在結(jié)直腸癌中表達(dá)水平及其臨床意義,未能進(jìn)一步探討其背后的機(jī)制及調(diào)控通路。

目前在臨床上常通過(guò)受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線計(jì)算曲線下面積(area under curve,AUC)來(lái)評(píng)估評(píng)估預(yù)測(cè)模型。但是AUC只是計(jì)算模型的準(zhǔn)確性和特異性之和,并沒(méi)有關(guān)注預(yù)測(cè)信息所導(dǎo)致的后續(xù)影響:例如臨床上需要更關(guān)注模型的特異性?；蛘逜UC評(píng)分較高的預(yù)測(cè)模型可能是由于其高敏感性,但特異性有限,因此在實(shí)踐中無(wú)法應(yīng)用,而人們也很難確定最優(yōu)的特異性與敏感性組合。在臨床決策分析理論中,通過(guò)引入損失函數(shù)便可以考察統(tǒng)計(jì)推斷結(jié)果的優(yōu)劣。決策曲線分析既是一種簡(jiǎn)潔易懂的數(shù)學(xué)模型,更兼顧臨床的可用性及效益。目前對(duì)于結(jié)直腸癌的預(yù)后預(yù)測(cè),臨床上多限定于TNM分期系統(tǒng),但TNM分期系統(tǒng)存在其自身缺點(diǎn),尤其是同一分期內(nèi)患者預(yù)后不盡相同。本研究通過(guò)目前較為認(rèn)可的決策曲線分析發(fā)現(xiàn)Her-2、Ki-67的檢測(cè)可以很好彌補(bǔ)TNM分期的不足,以納入Her-2、Ki-67、TNM分期的預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)效能明顯高于單純的TNM分期系統(tǒng),提示這兩個(gè)標(biāo)記物具有良好的臨床運(yùn)用價(jià)值。而目前兩指標(biāo)在絕大多數(shù)三級(jí)醫(yī)院都可以完成檢測(cè),臨床可推廣度高。

總而言之,Her-2與Ki-67在結(jié)直腸癌中蛋白表達(dá)水平升高,與結(jié)直腸癌惡性程度密切相關(guān),并且都是結(jié)直腸癌獨(dú)立預(yù)后因素,因此聯(lián)合檢測(cè)結(jié)直腸癌患者Her-2和Ki-67的表達(dá)水平具有重要預(yù)測(cè)價(jià)值,并為下一步指導(dǎo)靶向治療提供重要參考依據(jù)。

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