胡 霞,陳明龍,楊偉漢,馬 濤,王清清

(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室,蚌埠 233000;*通訊作者,E-mail:candywqq@163.com)

近年來,可溶微針貼片作為一種新型經(jīng)皮給藥劑型已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注,它是由水溶性材料和藥物混合制成[1-3],可溶微針材料一般為可溶性聚合物、蛋白或糖類,施用后,插入皮膚內(nèi)的微針在少量組織液中迅速溶解從而釋放藥物。目前可溶微針貼片研究多集中在大分子藥物方面,如蛋白、DNA等[4,5],對美白小分子藥物的相關(guān)研究鮮有報道。本課題組以透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)和聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP K90)作為制針材料,熊果(arbutin)苷作為美白小分子模型藥物,應(yīng)用兩步注模干燥法制備出可溶微針貼片[6]。

HPLC已被廣泛用于各種定量分析研究[7,8],但關(guān)于可溶微針貼片中藥物含量測定的相關(guān)研究少有報道。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法對可溶微針貼片中熊果苷進(jìn)行含量測定以及方法學(xué)驗(yàn)證。旨在建立一種準(zhǔn)確可行的可溶微針貼片中熊果苷的含量分析方法,為該種新型給藥制劑的質(zhì)量研究提供一定的理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(LC-15C,日本島津);雙光束紫外可見分光光度計(TU-1901,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);超聲波清洗器(KQ5200B,昆山市超聲儀器有限公司);十萬分之一電子分析天平(XP 205型,梅特勒-托利多公司);純水儀(Advantage A10,Milli-Q公司)。

1.2 試藥

可溶微針貼片(本課題組自制);熊果苷對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:111951-201301,純度:99.7%);透明質(zhì)酸(HA,華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司,批號:1510081);聚乙烯基吡咯烷酮(PVP K90,德國BASF,批號:L96014768E0);甲醇(上海麥克林生化科技有限公司,色譜純);水為超純水;其余所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Unitary C18100?柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:水-甲醇(90 ∶10);流速:1.0 ml/min;柱溫:25 ℃;檢測波長:282 nm;進(jìn)樣量:20 μl。在該色譜條件下,制針材料、模型藥物分離較好,與其他雜質(zhì)峰均能達(dá)到基線分離。

2.2 溶液的制備

2.2.1 熊果苷貯備液的制備 精密稱取熊果苷對照品粉末10.53 mg,置于100 ml容量瓶中,用超純水溶解并定容至刻度,配制濃度為105 μg/ml的熊果苷貯備溶液。

2.2.2 制針材料貯備液的制備 分別精密稱取HA、PVP K90各100 mg,置于100 ml容量瓶中,用超純水溶解并定容至刻度,配制濃度為1 mg/ml的制針材料貯備液。

2.2.3 可溶微針貼片水溶液的制備 用手術(shù)刀片對已制備好的可溶微針貼片進(jìn)行針部與基層分離,取針部溶解于1 ml去離子水中即得。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下配制的熊果苷貯備液、HA貯備液和PVP K90貯備液適量稀釋成適宜濃度的熊果苷溶液、HA溶液和PVP K90溶液。精密吸取這三種溶液和2.2項(xiàng)下配制的可溶微針貼片水溶液各20 μl,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,得到色譜圖。由圖1可以看出各制針材料溶液色譜圖在與熊果苷溶液色譜相應(yīng)的位置上無相同的色譜峰出現(xiàn),而可溶微針貼片水溶液與熊果苷溶液色譜相應(yīng)的位置上有相同的色譜峰出現(xiàn),表明制針材料對熊果苷含量測定無干擾。

圖1 HA、PVP K90、熊果苷和可溶微針貼片的HPLC圖Figure 1 High performance liquid chromatograms of HA,PVP K90,arbutin and DMNs

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2.1項(xiàng)下配制的熊果苷貯備液0.2,0.5,1,1.5,2,3,5,10 ml分別置于10 ml容量瓶中,以超純水定容,得到濃度為2.1,5.25,10.5,15.75,21,31.5,52.5,105.0 μg/ml的熊果苷系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照上述2.1項(xiàng)下色譜方法進(jìn)行分析,根據(jù)色譜圖譜計算峰面積,以峰面積(Y)對熊果苷濃度(X)進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為Y=49 409X-12 169(r=1)。結(jié)果表明,熊果苷進(jìn)樣濃度在2.1-105.0 μg/ml范圍內(nèi),與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

2.5.1 日內(nèi)精密度 精密吸取2.4項(xiàng)下配制的濃度為10.5,52.5,105.0 μg/ml的熊果苷標(biāo)準(zhǔn)工作液,按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測定3次,每次進(jìn)樣20 μl,結(jié)果見表1。試驗(yàn)結(jié)果表明3個濃度熊果苷標(biāo)準(zhǔn)工作液日內(nèi)精密度的平均RSD值為1.83%。

表1熊果苷的日內(nèi)精密度

Table1Intradayprecisionresultsofarbutin

濃度(μg/ml)峰面積平均峰面積SDRSD(%)平均RSD(%)10.5503017509725.678602.381.691.8350673651942452.52563675257972647259.631.8325425832632921105.050431575138194101220.201.9751267935244632

2.5.2 日間精密度 取2.5.1項(xiàng)下3個濃度的熊果苷標(biāo)準(zhǔn)工作液,于3 d內(nèi)每天的相同時段連續(xù)進(jìn)樣3次,每次進(jìn)樣20 μl,結(jié)果見表2。試驗(yàn)結(jié)果表明3個濃度熊果苷標(biāo)準(zhǔn)工作液日間精密度的平均RSD值為1.50%。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

按2.2項(xiàng)下方法配制各種貯備液,得到濃度為104 μg/ml的熊果苷貯備液與濃度均為1 mg/ml制針材料溶液,并按照表3配制藥物輔料混合溶液。熊果苷與混合輔料濃度比為1 ∶20,1 ∶10,1 ∶5,其中混合輔料濃度保持不變,總濃度為200 μg/ml,各輔料均為100 μg/ml。熊果苷濃度分別為10.4 μg/ml,20.8 μg/ml,41.6 μg/ml。將各混合溶液按含量測定方法測定,結(jié)果見表4。試驗(yàn)結(jié)果表明,熊果苷的平均回收率在97.22%-99.22%之間,RSD值均在0.67%-1.66%之間。

表2熊果苷的日間精密度

Table2Interdayprecisionresultsofarbutin

濃度(μg/ml)峰面積平均峰面積SDRSD(%)平均RSD(%)10.5509725.675075366348.981.251.50500382512500.3352.52579726258615835644.721.3825541672624581105.05138194509314595279.991.8751575474983694

表3加樣回收率試驗(yàn)樣品配制方法

Table3Sampleofpreparationmethodsforrecoverytest

藥物輔料濃度比熊果苷(104 μg/ml)Dex(1 mg/ml)PVP K90(1 mg/ml)超純水1∶201 ml1 ml1 ml定容至10 ml1∶102 ml1 ml1 ml定容至10 ml1∶5 4 ml1 ml1 ml定容至10 ml

表4熊果苷的加樣回收率

Table4Recoveryresultofdeterminationofarbutin

加入濃度(μg/ml)實(shí)測濃度(μg/ml)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)10.410.3399.3398.911.1610.3899.8110.1597.6020.820.87100.3499.221.6620.80100.0020.2497.3141.640.1896.5997.220.6740.4197.1440.7497.93

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取實(shí)驗(yàn)室自制的同一批可溶微針貼片6片,分別用手術(shù)刀片進(jìn)行針部與基層分離,取針部分別于1 ml去離子水中完全溶解后按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,計算每片可溶微針貼片針部的熊果苷載藥量。結(jié)果得出平均每片可溶微針貼片中熊果苷的含量為30.65 μg,RSD為0.82%(n=6),表明方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.7項(xiàng)下某一可溶微針貼片溶液,分別于0,1,2,4,6,12,24 h進(jìn)樣,測定峰面積,熊果苷峰面積RSD值為1.60%(n=7),結(jié)果表明可溶微針貼片溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 討論

使用雙光束紫外可見分光光度計分別對熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液及制針材料溶液進(jìn)行全光譜掃描，掃描波長范圍為200-700 nm。從掃描譜圖中可看出熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液在282 nm處有最大吸收峰，且當(dāng)檢測波長為282 nm時系統(tǒng)專屬性良好，故本實(shí)驗(yàn)選擇282 nm作為檢測波長。參考相關(guān)文獻(xiàn)[9-11]，將甲醇-水為10 ∶90和20 ∶80以及鹽酸緩沖液(0.1 mol/L鹽酸水溶液-水為1 ∶89)-甲醇為95 ∶5這三種流動相依次進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)，流速為1.0 ml/min。結(jié)果表明，在流動相為甲醇-水為10 ∶90時，熊果苷色譜峰保留時間適宜，峰形良好。并且各制針材料溶液色譜圖在與熊果苷溶液色譜相應(yīng)的位置上無相同的色譜峰出現(xiàn)。本文建立了HPLC法測定可溶微針貼片中熊果苷的含量，此方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、精密度高、選用的制針材料無干擾，可作為可溶微針貼片中熊果苷含量測定質(zhì)量控制方法。

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