董向輝,徐翠香,孫正明,常彥海,凌 鳴*

(1陜西省人民醫(yī)院骨科,西安 710068;2陜西省臨床檢驗中心;*通訊作者,E-mail:m.ling0114@163.com)

前交叉韌帶(anterior cruciate ligament,ACL)是膝關(guān)節(jié)的重要穩(wěn)定結(jié)構(gòu)之一[1],其損傷多發(fā)于運動員及喜愛運動的普通人群中,隨著全民運動的日益展開及民眾健康需求的不斷提高,ACL損傷發(fā)病率呈逐年上升趨勢,損傷后韌帶不能自行愈合,需要手術(shù)重建[2]。移植物的腱-骨愈合是臨床醫(yī)生關(guān)心的重要問題,是手術(shù)成敗的關(guān)鍵。移植物的種類、固定方式、炎性細(xì)胞因子和關(guān)節(jié)滑液的浸泡等是影響ACL重建預(yù)后的重要因素[3,4],而外傷、手術(shù)刺激、關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥反應(yīng)等直接和間接地改變著關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境,本實驗在ACL重建基礎(chǔ)上,通過術(shù)后早期關(guān)節(jié)腔沖洗減少滑液及炎癥介質(zhì)改變關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境的方法,探索其對移植物腱-骨愈合界面的組織學(xué)影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

8-10月雄性新西蘭大白兔24只,體質(zhì)量3-3.5 kg,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供,隨機編號,分籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)室溫度22-25 ℃,相對濕度40%-60%,每日定時給予紫外線消毒。所有動物術(shù)前活動正常,膝關(guān)節(jié)無腫脹,雙側(cè)膝關(guān)節(jié)抽屜試驗、Lachman征均為陰性。每只動物雙側(cè)均建立以踇長伸肌腱為移植物的ACL重建模型。隨機選取一側(cè)膝作為實驗組,術(shù)后早期給予關(guān)節(jié)腔沖洗,對側(cè)不作處理作為對照組。額外飼養(yǎng)2只并制成模型備用,以便補充動物死亡、傷口感染等引起的標(biāo)本丟失。

1.2 ACL重建方法

術(shù)前準(zhǔn)備:3.3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg)經(jīng)耳緣靜脈注射行全身麻醉,用硫化鈉進(jìn)行膝關(guān)節(jié)周圍脫毛處理,肌肉注射40萬U青霉素預(yù)防感染。

建立模型:常規(guī)消毒鋪巾,取膝關(guān)節(jié)正中切口,顯露前交叉韌帶,在股骨、脛骨附著處將其完全切斷,檢查前抽屜試驗及Lachman征均為陽性,證明前交叉韌帶已完整切除。取脛骨下段內(nèi)側(cè)縱形切口,約2 cm,分離并取出踇長伸肌腱,剔除肌肉部分后對折,兩端均用絲線編織,并在兩端保留10 cm長的縫線以作預(yù)張及重建手術(shù)時牽引使用,沖洗并縫合切口,測量編織肌腱的直徑,并預(yù)張10 min,置于生理鹽水中備用。

屈膝45°,用1 mm的克氏針以原ACL起止點為標(biāo)記分別鉆取脛骨及股骨骨道,根據(jù)測量的肌腱直徑,選取與其直徑相近的鉆頭沿克氏針方向擴大骨髓道,并在骨道出口處鉆取骨橋備用,將移植物經(jīng)牽引線依次穿過脛骨、股骨骨道,屈膝60°將牽引線穿過骨橋打結(jié)固定。再次檢查抽屜試驗前拉及Lachman均為陰性。用雙氧水及生理鹽水清洗傷口,實驗側(cè)膝關(guān)節(jié)放置沖洗管于關(guān)節(jié)腔內(nèi),遠(yuǎn)端由切口旁皮下引出并固定于皮膚上,嚴(yán)密縫合切口,碘伏消毒后包扎,術(shù)后分籠飼養(yǎng),自由活動。術(shù)后實驗組連續(xù)5 d每天定時9:00用生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔內(nèi)一次,直至流出液清亮為止,對照組不做處理,并給予40萬U青霉素肌肉注射,連續(xù)5 d,預(yù)防感染,5 d后拔除沖洗管。

1.3 獲取股骨-移植韌帶-脛骨標(biāo)本

分別在術(shù)后第4,8,12周時,用空氣栓塞法處死8只實驗動物,在脛骨和股骨骨髓道關(guān)節(jié)外口的遠(yuǎn)端和近端2 cm處切斷股骨、脛骨,剔除膝關(guān)節(jié)周圍除關(guān)節(jié)囊及韌帶以外的其余軟組織,保留完整的膝關(guān)節(jié)內(nèi)結(jié)構(gòu),標(biāo)本置于10%的甲醛溶液中固定。

1.4 蘇木精-伊紅染色

剔除標(biāo)本周圍軟組織,經(jīng)常規(guī)脫鈣處理,進(jìn)行HE染色。在顯微鏡下觀察腱骨界面愈合過程中的組織學(xué)變化,隨機選取5個高倍視野進(jìn)行成纖維細(xì)胞計數(shù),計算平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

術(shù)后第4周,實驗組移植肌腱與骨髓道貼附較緊密,腱-骨界面之間可見成纖維細(xì)胞生長活躍,少量炎細(xì)胞存在,有成骨反應(yīng)及新生血管形成;對照組骨髓道壁與移植肌腱之間部分區(qū)域間隙相對較大,連接松散,之間可見少量新生血管、成纖維細(xì)胞及較多的炎細(xì)胞,炎癥反應(yīng)明顯(見圖1)。

術(shù)后第8周,實驗組髓道壁與移植肌腱間連接緊密,由致密的纖維結(jié)締組織構(gòu)成,以排列規(guī)則的膠原纖維為主,可見較多成纖維細(xì)胞,炎性細(xì)胞減少,靠近骨髓道壁側(cè)成骨活躍,分布有較多細(xì)胞核呈類圓形的成軟骨細(xì)胞,并向肌腱側(cè)移行;對照組髓道壁與移植肌腱之間連接相對緊密,成纖維細(xì)胞較多,膠原纖維排列紊亂,毛細(xì)血管減少,骨髓道壁側(cè)可見成骨反應(yīng)(見圖1)。

術(shù)后第12周,實驗組髓道壁與移植肌腱界面區(qū)膠原纖維大量產(chǎn)生,排列有序,靠近骨髓道壁側(cè)見大量新生骨組織,包含纖維軟骨及鈣化軟骨,部分區(qū)域膠原纖維、纖維軟骨、鈣化軟骨、骨層次較為清晰;對照組髓道壁與移植肌腱界面區(qū)連接緊密,膠原纖維較多,排列較規(guī)則,髓道側(cè)可見成骨細(xì)胞增生及成軟骨細(xì)胞分布(見圖1)。

ACL重建術(shù)后第4，8和12周,實驗組腱-骨界面成纖維細(xì)胞生長活躍,膠原纖維排列規(guī)則有序,成骨活躍,對照組成纖維細(xì)胞相對較少,膠原纖維排列紊亂,成骨反應(yīng)相對延遲;腱-骨界面成纖維細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示:實驗組腱-骨界面成纖維細(xì)胞計數(shù)在各個時間點與對照組相比較,差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。ACL重建術(shù)后實驗組和對照組腱-骨界面成纖維細(xì)胞均逐漸增加,在第8周末最多,此后逐漸下降,但對照組下降更為明顯(見表1)。

ACL重建術(shù)后,實驗組腱-骨界面成纖維細(xì)胞生長活躍,膠原纖維排列規(guī)則有序,成骨活躍;對照組成纖維細(xì)胞相對較少,膠原纖維排列紊亂,成骨反應(yīng)相對延遲圖1 ACL重建術(shù)后不同時間實驗組和對照組腱-骨界面組織學(xué)形態(tài)(蘇木精-伊紅染色,×100)Figure 1 Morphology of tendon-bone interface in experimental group and control group at weeks 4,8,12 after ACL reconstruction (Hematoxylin-eosin staining,×100)

分組4周8周12周實驗組33.25±2.12*45.50±3.46*38.37±1.69*對照組24.75±2.2535.50±1.6029.35±2.49

與對照組相比,*P<0.01

3 討論

前交叉韌帶重建后移植物與骨髓道之間的愈合過程復(fù)雜,影響因素較多,比如移植物的類型、微動及應(yīng)力、固定方式、康復(fù)過程、骨髓道位置以及炎性細(xì)胞因子和關(guān)節(jié)滑液的浸泡等。移植肌腱為了適應(yīng)新的環(huán)境一般都要經(jīng)歷一個組織缺血壞死,新生血管、膠原纖維等新組織長入替代及韌帶塑形改建的過程[5,6]。前交叉韌帶急性損傷期、重建時鉆取骨道引起的骨壞死、關(guān)節(jié)內(nèi)清理等直接和間接損傷的刺激均會誘發(fā)及加重腱-骨交界面的炎癥反應(yīng),而關(guān)節(jié)液內(nèi)白細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子等的濃度變化會明顯影響腱骨愈合,如破骨細(xì)胞激活促進(jìn)骨質(zhì)吸收,降解骨基質(zhì)[7]。本實驗通過早期關(guān)節(jié)腔沖洗來減少術(shù)后滑液及炎癥介質(zhì)以改善關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境的方法來觀察其對腱骨愈合的影響。

前交叉韌帶損傷或者重建后關(guān)節(jié)滑液的量和性質(zhì)發(fā)生明顯改變,ACL損傷患者的關(guān)節(jié)滑液中IL-1、IL-6、干擾素γ、巨噬細(xì)胞炎性蛋白1β及TNF-α等炎癥因子含量較正常顯著增高[8],1周后逐漸降低,但仍高于正常[9]。Xue等[10]對前交叉韌帶斷裂的鼠進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)MMP的含量顯著增加,并認(rèn)為是與韌帶愈合差有關(guān),但更為重要的原因是損傷后關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境的改變。Demirag等[11]研究兔ACL重建術(shù)后用α2巨球蛋白封閉關(guān)節(jié)滑液中的MMP,實驗組中MMP含量明顯下降,并促進(jìn)了腱-骨愈合,認(rèn)為是α2巨球蛋白封閉MMPS或者膠原酶,改變關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境的結(jié)果。用保留交叉韌帶殘端的方法進(jìn)行重建可以促進(jìn)腱-骨愈合,其原因是保留的韌帶殘端可以減少關(guān)節(jié)滑液向骨髓道中滲漏或反流[12]。

本實驗組織學(xué)觀察表明,實驗組的成纖維細(xì)胞形成和成骨反應(yīng)的表現(xiàn)均優(yōu)于對照組,滑膜爬行覆蓋出現(xiàn)較早,膠原纖維排列規(guī)整,腱骨之間貼附連接較對照組緊密。成纖維細(xì)胞的數(shù)量經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析顯示,隨著術(shù)后時間的延長,成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢,但在觀察的各時間點數(shù)量上明顯多于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。正常前交叉韌帶是由平行走行、波浪狀排列的致密結(jié)締組織構(gòu)成,主要基質(zhì)成分是膠原纖維[13,14],而成纖維細(xì)胞是合成膠原的主要細(xì)胞。ACL重建術(shù)后移植肌腱缺乏血供,韌帶表面部分纖維束會逐漸壞死,早期不能形成有效的自我修復(fù),術(shù)后2周腱-骨界面之間主要被肉芽組織及炎細(xì)胞充填[15]。肉芽組織主要是由大量毛細(xì)血管及豐富的成纖維細(xì)胞構(gòu)成,隨著時間延長,肉芽組織逐漸成熟為纖維結(jié)締組織并已經(jīng)對移植肌腱形成有效的包裹覆蓋,移植肌腱表面再血管化,成纖維細(xì)胞長入,而骨髓道壁側(cè)血運豐富,軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞增生活躍,向腱骨界面之間的結(jié)締組織形成有效的骨長入,形成了術(shù)后早期骨組織-結(jié)締組織-移植肌腱的結(jié)構(gòu)層次。早期關(guān)節(jié)腔沖洗后可以明顯減少關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑液及炎癥介質(zhì)的量,使其對腱骨界面間的肉芽組織破壞減少,局部成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯優(yōu)于對照組,膠原纖維規(guī)律的排列分布發(fā)生更早,從而形成更具方向性的膠原纖維[16]。ACL重建手術(shù)后由于直接及間接的損傷引起的關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎癥反應(yīng),關(guān)節(jié)滑液量明顯增多,滑液中炎癥介質(zhì)的含量發(fā)生明顯改變,各種分解性的酶類增多,平衡失調(diào),關(guān)節(jié)腔的內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變,加重關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的損傷[17],并且移植韌帶內(nèi)缺乏血液供應(yīng),腱周沒有結(jié)締組織包裹,與滑液、炎癥細(xì)胞及介質(zhì)等直接接觸。同時,滑液沿著移植物與骨髓道之間的縫隙流入,對腱-骨界面的愈合產(chǎn)生不利影響[18,19],造成腱-骨愈合進(jìn)程減慢。由此可見,早期關(guān)節(jié)腔沖洗可減少關(guān)節(jié)內(nèi)滑液及炎癥介質(zhì),改善關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境,增加腱-骨界面之間成纖維細(xì)胞的數(shù)量,形成更具方向性的膠原纖維,從而促進(jìn)腱-骨愈合。

因此,本研究認(rèn)為,前交叉韌帶重建后可以通過早期關(guān)節(jié)腔沖洗的方法改善關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境,促進(jìn)腱-骨界面膠原纖維形成,進(jìn)而促進(jìn)腱-骨愈合。

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