何 蕊,張王剛,楊 楠,劉 捷,張鵬宇,李軍輝

(1西安交通大學第二附屬醫(yī)院腫瘤病院,西安 710004;2西安交通大學第二附屬醫(yī)院血液科;3西安交通大學第二附屬醫(yī)院普外科;*通訊作者,E-mail:zhangwanggang2003@yahoo.com)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一種伴隨免疫損害的克隆性漿細胞異常增生性疾病[1]。目前,本病已經(jīng)上升為常見血液系統(tǒng)惡性腫瘤的第二位,因此死亡的患者占血液惡性腫瘤死亡患者的15%-20%[2,3]。近年來,靶向治療藥物硼替佐米以及免疫抑制劑沙利度胺、來那度胺等藥物的出現(xiàn),很大地改善了多發(fā)性骨髓瘤患者的預后[4-6]。由于骨髓瘤細胞增殖比例很低,多藥耐藥的形成,多發(fā)性骨髓瘤的治療反應較差,迄今仍被認為是難以治愈的疾病,很多骨髓瘤患者仍然面臨著疾病復發(fā),進展的風險[7]。MMSA-8是本實驗室利用“重組cDNA表達文庫血清分析法(serological identification of antigens by recombinant expression cloning, SEREX)”篩選出的一個骨髓瘤相關基因，先前的研究提示MMSA-8基因在多發(fā)性骨髓瘤患者中表達水平高于正常人群,此外MMSA-8的表達水平還與疾病狀態(tài)及預后具有明顯相關性[8]。為進一步研究MMSA-8在骨髓瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,本研究采用慢病毒介導的RNA干擾技術(shù)下調(diào)骨髓瘤細胞RPMI8226的MMSA-8表達水平,觀察其對RPMI8226細胞增殖和侵襲能力的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞株、質(zhì)粒及主要試劑

人骨髓瘤細胞RPMI8226購于北京協(xié)和細胞中心;質(zhì)粒pGC-FU-GFP-MMSA-8①、pGC-FU-GFP-MMSA-8②、pGC-FU-GFP-MMSA-8③(購自上海吉凱基因有限公司)。RPMI1640培養(yǎng)基(HyClone公司,美國);胎牛血清(FBS,HyClone公司,美國);Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen公司,美國);侵襲小室(BD公司,美國);MTT試劑盒(Promega,美國);G418(鼎國生物技術(shù)公司,北京);RIPA裂解液(碧云天生物信息研究所,中國);BCA蛋白檢測試劑盒(博澳森生物公司,中國);Trizol試劑盒(Invitrogen公司,美國);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara,大連,中國);SYBR Green PCR試劑盒(Takara,大連,中國),MMSA-8特異性單克隆抗體(ab111598,Abcam,美國);P53特異性單克隆抗體(Abcam,美國);MDM2特異性單克隆抗體(Abcam,美國);抗β-actin和酶標二抗(博士德,武漢)。

1.2 細胞培養(yǎng)

人骨髓瘤細胞RPMI8226培養(yǎng)于含15%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4-5 d傳代1次,取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 重組載體構(gòu)建

根據(jù)GenBank登錄已知基因序列(AY952889),按siRNA的設計原則設計引物。三條干擾序列:①5′-TTAGTCCAGCAAGCAATAGTA-3′；②5′-TAGATTCCTGCAAATTTCATG-3′；③5′-AGAAGGTAGTCAGCCAAGCAC-3′；以上序列均由上海吉凱基因公司設計合成。分別定向克隆入pGC-FU-GFP載體，成為pGC-FU-GFP-MMSA-8①、pGC-FU-GFP-MMSA-8②、pGC-FU-GFP-MMSA-8③，以空載體pGC-FU-GFP(Mock)為對照。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染及篩選

取對數(shù)生長期的RPMI8226細胞,用15% FBS,不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基接種于96孔板中,待細胞密度達70%時,進行轉(zhuǎn)染。同時以空載體(Mock)組為陰參組,未做任何處理組為空白組。將2 μl LipofectamineTM2000加入48 μl無血清培養(yǎng)基中混勻(A液)，37 ℃孵育5 min，分別將1 μl重組質(zhì)粒pGC-FU-GFP-MMSA-8①、pGC-FU-GFP-MMSA-8②、pGC-FU-GFP-MMSA-8③和1 μl對照質(zhì)粒pGC-FU-GFP加入49 μl無血清培養(yǎng)基中混勻(B液)，室溫孵育5 min。將如上A、B兩液混勻，37 ℃孵育20 min。D-Hank’s液洗滌1次，加入2 ml含血清RPIM1640培養(yǎng)基，在加入含有質(zhì)粒的混合液混勻置培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)4-6 h。離心更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，加入含400 μg/ml G418的培養(yǎng)基篩選陽性克隆。

1.5 Q-PCR檢測MMSA-8的mRNA表達水平

RNA干擾后72 h收集細胞,PBS洗滌2-3次,用Trizol提取細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照SYBR Green PCR試劑盒說明操作,使用ABI RPISM 7500實時定量PCR系統(tǒng)完成Real time PCR反應。內(nèi)參β-actin上游引物5′-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′,下游引物5′-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。MMSA-8上游引物5′-ACCCTCGGATACGATAGAAAATG-3′,下游引物5′-CACCACCACGAAGTCTCAACA-3。擴增條件：預變性95 ℃ 3 min，95 ℃ 7 s，57 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。

1.6 Western blot檢測MMSA-8的蛋白表達水平

RNA干擾后72 h收集細胞,PBS洗滌2-3次,加入細胞裂解液裂解細胞提取總蛋白,用BCA法測定蛋白濃度,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后,加入一抗:特異性抗-MMSA-8抗體1 ∶200(ab111598 Abcam,美國)和β-actin一抗1 ∶2 000,4 ℃孵育過夜，加入二抗1 ∶5 000,搖床溫和搖動1 h。加入SuperSignal化學發(fā)光盒的液體,Image-Pro Plus圖像分析管理系統(tǒng)照相,采用Bandscan軟件測定各條帶積分光密度IOD值,將各目的條帶的灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值相比,得到各指標比值。檢測P53及MDM2蛋白步驟同上。

1.7 MTT法測定MMSA-8對RPMI8226細胞增殖能力的影響

RNA干擾后72 h,將空白組、陰參組及干擾效果最優(yōu)組細胞懸浮于RPMI1640完全培養(yǎng)基中,調(diào)整細胞密度為1×103個/孔,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔200 μl培養(yǎng)液;每孔設3個復孔。于1,2,3,4,5,6,7時檢測,每孔加入新配制MTT液(5 mg/ml)20 μl,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄培養(yǎng)液,每孔加入DMSO 150 μl,室溫下振蕩5 min,靜置10 min。酶標儀492 nm處測定吸光度A值,計算均值,繪制生長曲線。

1.8 流式細胞儀檢測細胞周期

使用PI法檢測細胞周期。過程:收集1×106個細胞,PBS洗細胞2次,加入1 ml生理鹽水制成單細胞懸液。加入預冷的無水乙醇2 ml快速混勻,固定細胞。棄固定液,PBS洗細胞2次,離心去上清,加入PI溶液(20 μg/ml)1 ml,4 ℃避光染色15 min,流式細胞儀分析。

1.9 Transwell侵襲實驗檢測MMSA-8對RPMI8226細胞侵襲能力的影響

將小鼠成纖維細胞NIH3T3用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),當細胞達75%融合度時,用PBS洗瓶3次,換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,離心收集培養(yǎng)液上清,-70 ℃保存?zhèn)溆?。?0 mg/L Matrigel處理Transwell小室的聚碳酸濾膜小室底部膜的上室面,在室溫下干燥過夜。轉(zhuǎn)染后72 h,將上述三組細胞懸浮于無血清RPMI1640培養(yǎng)基中,計數(shù),取8×104個接種于成膠后的小室上室,下室每孔加入800 μl收集的NIH3T3細胞培養(yǎng)上清液和含20%FBS的RPMI1640的培養(yǎng)基(1 ∶1混合液)。培養(yǎng)24 h后,取出Transwell小室,用棉簽擦掉Matrigel基質(zhì)膠,PBS洗滌3次,95%乙醇固定15 min,結(jié)晶紫染色,揭下Transwell小室膜反貼在載玻片上。顯微鏡(×200)計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 慢病毒介導的RNA干擾細胞系的構(gòu)建

對五組轉(zhuǎn)染后的細胞行G418篩選,挑單克隆細胞擴大培養(yǎng)(見圖1A,B)。Q-PCR實時定量檢測MMSA-8 mRNA的表達水平檢測(β-actin為內(nèi)參基因),結(jié)果顯示,RNAi1,RNAi2以及RNAi3組的MMSA-8表達水平均低于空白組和陰參組,其中RNAi3組細胞中MMSA-8 mRNA表達水平最低(P<0.05),進一步采用Western blot檢測MMSA-8蛋白表達水平,結(jié)果顯示,shRNA干擾組(RNAi1,RNAi2以及RNAi3)MMSA-8表達水平均低于陰參組和空白組,RNAi3組細胞中MMSA-8蛋白水平最低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖1C)。說明我們特異性地建立了慢病毒介導的MMSA-8的shRNA干擾細胞系,RNA干擾后的RPMI8226細胞MMSA-8表達水平明顯降低。我們用干擾效果最好的RNAi3組細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 MMSA-8 shRNA對RPMI8226細胞增殖能力的影響

圖1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGC-FU-GFP-MMSA-8的實驗結(jié)果Figure 1 Results of cells with stable transfection pGC-FU-GFP-MMSA-8

對空白組、陰參組和干擾效果最好的RNAi3組進行MTT檢測,繪制生長曲線,比較不同組細胞的增殖能力。結(jié)果顯示:空白組、陰參組RPMI8226細胞的生長速度基本一致;而RNAi3組的細胞生長明顯變慢,組間差異比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖2)。表明MMSA-8的表達下調(diào)能夠明顯地抑制RPMI8226細胞的增殖。

2.3 MMSA-8 shRNA對RPMI8266細胞周期分布的影響

用流式細胞儀分析空白組、陰參組、RNAi3組細胞在培養(yǎng)72 h后細胞周期的改變。結(jié)果顯示:空白組、陰參組、RNAi3組細胞在培養(yǎng)72 h后,G1期、S期、G2期之間比例在三組細胞間無明顯差異(P>0.05,見圖3);表明抑制MMSA-8的表達對RPMI8226細胞周期無明顯影響。但是,RNAi3組細胞在sub-G1期的比例明顯增大(見圖3C),這就提示MMSA-8的表達下調(diào)可能誘導RPMI8226細胞的凋亡,因為凋亡細胞在細胞周期分析中一般處于sub-G1期。

與空白組、陰參組比較,*P<0.05圖2 MMSA-8下調(diào)抑制了RPMI8226細胞的增殖Figure 2 Downregulation of MMSA-8 inhibited RPMI8226 cell proliferation

圖3 各組RPMI8226細胞各周期時相FCM結(jié)果比較Figure 3 Cell Cycle of RPMI8226 cells after different transfection by FCM

2.4 MMSA-8shRNA對RPMI8226細胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實驗顯示,空白組72 h后穿膜細胞數(shù)是26.6±2.18,陰參組細胞穿膜數(shù)是25.6±2.49,pGC-FU-GFP-MMSA-8③組穿膜細胞數(shù)是13.8±1.38。RNAi組(pGC-FU-GFP-MMSA-8③組)穿膜細胞數(shù)較空白組和陰參組顯著降低(P<0.01,見圖4)。空白組和陰參組之間穿膜細胞數(shù)無統(tǒng)計學差異。說明抑制MMSA-8在骨髓瘤細胞RPMI8226中的表達,可以明顯抑制骨髓瘤細胞體外實驗中的侵襲能力。

圖4 MMSA-8下調(diào)對RPMI8226細胞侵襲力的影響Figure 4 Effect of downregulating MMSA-8 on RPMI8226 cell invasion

2.5 下調(diào)MMSA-8表達水平,影響P53與MDM2調(diào)控體系

Western blot結(jié)果顯示,RNAi3組中MDM2蛋白水平與對照組(空白組,陰參組)比較明顯下降(P<0.05),空白組與陰參組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖5)。而P53蛋白水平在RNAi3組中明顯上升(p<0.05),空白組與陰參組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖5)。

圖5 MMSA-8表達下調(diào)對RPMI8226細胞P53、MDM2表達的影響Figure 5 Expression of P53 and MDM2 in RPMI8226 cells after downregulating MMSA-8

3 討論

近年來,基因治療中運用病毒載體已被大家認可,特別是對于慢病毒載體的研究與發(fā)展更加突飛猛進。與腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒相比,慢病毒載體不僅可以攜帶基因感染和整合入細胞,而且其轉(zhuǎn)染效率高,可在宿主細胞長期、穩(wěn)定表達[9]。目前,第3代慢病毒載體可顯著減弱免疫原性,在基因表達方面成功地實現(xiàn)了先體外后體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移。一般情況下,懸浮細胞轉(zhuǎn)染效率較低,本研究采用慢病毒介導的RNA干擾技術(shù),選擇RPMI8226懸浮細胞作為實驗對象,選擇第3代慢病毒載體以期達到更高效率的轉(zhuǎn)染效果,以及得到長期穩(wěn)定傳代的MMSA-8下調(diào)的RPMI8226細胞株。針對MMSA-8的mRNA序列設計合成了特異性的3條shRNA,通過Q-PCR和Western blot實驗驗證RNA干擾后RPMI8226細胞MMSA-8的mRNA和蛋白水平均有下降,其中pGC-FU-GFP-MMSA-8③組下降最為明顯,說明在RPMI8226細胞中成功地過通過RNA干擾降低了MMSA-8基因表達,并成功構(gòu)建了低表達MMSA-8的穩(wěn)定傳代細胞株。

MMSA-8是本實驗室利用重組cDNA表達文庫血清分析法(SEREX)篩選出的一個骨髓瘤相關基因,經(jīng)過NCBI的Blast比對分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn):新獲MMSA-8的序列完全覆蓋RPS27A轉(zhuǎn)錄本1序列(NCBI Reference Sequence:NM-002954.5),它們是相同的序列[8]。RPS27A基因編碼連接泛素N端和核糖體蛋白S27A的C端的蛋白質(zhì)。泛素-RPS27a前體蛋白很快的被特異化水解為泛素單體[10-12]。此外,在一些研究中提示RPS27a還具有核糖體蛋白之外的功能,RPS27a在小鼠肝癌及一些人類腫瘤中過表達[13-15]。本實驗室前期實驗發(fā)現(xiàn)MMSA-8(transcript variant 1 of RPS27A)在多發(fā)性骨髓瘤患者中高表達,且表達水平與疾病狀態(tài)及預后具有明顯相關性。并且在P53缺失的患者中,MMSA-8的表達水平高于其他患者[8]。為了進一步研究MMSA-8對骨髓瘤細胞增殖、侵襲的影響。我們用MTT實驗來分析MMSA-8下調(diào)后對RPMI8226細胞增殖的影響。從MTT實驗可見,RNAi組細胞增殖速率均明顯低于陰參組和空白組,說明MMSA-8表達水平降低骨髓瘤細胞RPMI8226增殖被抑制,在骨髓瘤細胞RPMI8226中可能是促進腫瘤細胞增殖的因素之一,這一實驗結(jié)果與之前的研究相符[13,15]。流式細胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):MMSA-8表達下調(diào)后,細胞在G1期、S期、G2期之間比例無明顯變化,但是在sub-G1期的比例明顯增大,這就提示MMSA-8的表達下調(diào)可能誘導RPMI8226細胞的凋亡,因為凋亡細胞在細胞周期分析中一般處于sub-G1期[15]。也就是說MMSA-8可能在RPMI8226細胞生長中有抗凋亡的作用。在Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示,RNA干擾組穿膜的細胞數(shù)明顯減少,表明下調(diào)MMSA-8的表達水平可以顯著抑制骨髓瘤細胞RPMI8226的體外的侵襲性。

上述體外實驗提示,MMSA-8的表達水平影響著RPMI8226細胞的增殖、凋亡和侵襲行為。MMSA-8可能是一個促進RPMI8226細胞增殖、侵襲以及抗凋亡的調(diào)控基因。為進一步研究MMSA-8影響RPMI8226細胞生物學行為的機制,根據(jù)以往研究提示RPS27A(MMSA-8)可能是P53轉(zhuǎn)錄的靶點,其過表達與DNA損傷有關[16]。RPS27a與MDM2相互作用,可能影響MDM2介導的P53遍在蛋白化,影響P53激活及細胞周期停滯[17]。本實驗對MMSA-8表達下調(diào)后P53、MDM2表達水平進行檢測,發(fā)現(xiàn):MMSA-8表達降低的同時,MDM2表達水平降低,P53表達水平升高。因此推測:在多發(fā)性骨髓瘤中DNA損傷導致MMSA-8高表達,其高表達又通過MDM2-P53環(huán)路抑制P53的激活,從而導致骨髓瘤細胞的增殖及惡性演進。降低MMSA-8表達水平,MDM2表達水平降低,P53表達水平升高,RPMI8226細胞增殖減慢,侵襲力下降。

綜上所述,MMSA-8在促進骨髓瘤細胞RPMI8226增殖、侵襲中具有重要作用。并且這一作用可能是通過調(diào)控MDM2-P53環(huán)路,調(diào)節(jié)P53的表達水平實現(xiàn)的。通過本研究不僅有助于我們更全面探索多發(fā)性骨髓瘤的生物學行為,也為多發(fā)性骨髓瘤的生物治療提供新的靶點。

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