劉 棟,王建華△,段降龍,孫學軍,劉 斌,武 敏,劉思達,毛智軍,張 濤,薛飛,普彥淞,李曉帆,高增戰(zhàn)*,龍延濱

(1陜西省人民醫(yī)院普外二科,西安 710068;2西安交通大學第一附屬醫(yī)院普外科;3陜西省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科;△共同第一作者;*通訊作者,E-mail:gaoxi8004@163.com)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一,由于臨床表現(xiàn)缺乏特異性導致診斷時往往處于晚期、惡性程度高導致預后差。在我國發(fā)病率居于惡性腫瘤的第2位,死亡率居惡性腫瘤第3位[1]。根治性手術(shù)術(shù)后輔助化療可以延長生存期,但是由于有些患者對化療耐藥,療效有限,傳統(tǒng)生物標志物在胃癌的診治中缺乏理性的特異性及敏感性,所以臨床迫切需要尋找新的胃癌生物學標記物,提高血清標記物在胃癌診治中的診斷及實時監(jiān)測。microRNA(miRNA)是一類長度為21-25個核苷酸的小型非編碼RNA,并在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達,參與多種生理病理過程[2]。miRNA-582作為近年來參與腫瘤發(fā)展中的重要角色的微小RNA成員之一,目前研究表明miRNA-582涉及到膀胱癌[3]和結(jié)直腸癌[4]等腫瘤細胞生長及侵襲遷移的多種生物學進程中,但是結(jié)果仍有相互矛盾之處,前期我們的研究結(jié)果也表明miRNA-582與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲有關(guān),但是在化療耐藥中的機制尚未明確。LGR5是一種跨膜受體,屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員,已經(jīng)證實在多種人類實體腫瘤中高度表達,通過增強Wnt信號通路的活性,加速癌細胞的增殖及腫瘤形成[5]。本研究擬檢測miR-582-5p在胃癌細胞AGS中調(diào)控胃癌細胞增殖能力、化療藥物奧沙利鉑耐藥性、細胞周期變化,探討miR-5825p作為胃癌治療靶點的可能性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Scientific公司;real-time PCR試劑購自日本TaKaRa公司,Trizol試劑購自美國Invitrogen公司;miR-582-5p、U6引物由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計并合成;RPMI-1640、胎牛血清、OPTI-MEN購自美國Gibco公司;LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司;Annexin Ⅴ-FITC試劑盒購自美國BD公司;MTT購自美國Sigma公司;miR-582-5p mimic和Negative Control(NC)由上海吉瑪公司生產(chǎn);LGR5、cyclinD1、c-myc、surviven、MDR1和GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司。real-time PCR檢測儀器為美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的CFX96TMreal-time PCR Detection System;凝膠成像儀購自美國Bio-rad公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

胃癌AGS細胞(西安交通大學醫(yī)學院中心實驗室饋贈)接種于RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),置于37 ℃、5% CO2+95%空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng),定期觀察并每隔2 d更換細胞培養(yǎng)液1次,待細胞長滿約80%時用0.25%胰蛋白酶消化傳代,取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 real-time PCR檢測miR-582-5p

用Trizol試劑按照操作說明對AGS細胞進行總RNA提取,各組細胞分別取2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,行real-time PCR。反應條件:95 ℃預變性30 s;然后95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。以每個樣本的U6作為內(nèi)參,基因相對表達量采用2-ΔΔCt方法進行計算分析。實驗重復3次。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染

將對數(shù)生長期AGS細胞經(jīng)0.25%胰酶消化,取2×104個接種于6孔板,按實驗設(shè)計分實驗組(轉(zhuǎn)染miR-582-5p mimics)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染negative control)和空白對照組(untreated cell)。用250 μl OPTI-MEN稀釋LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑5 μl室溫下靜置5 min,再用250 μl OPTI-MEN稀釋miR-582-5p mimics或Negative Control 5 μl,兩者混合室溫下靜置20 min,每孔加入500 μl轉(zhuǎn)染復合液,在37 ℃含5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h,用新鮮的含血清1640培養(yǎng)基替換含有轉(zhuǎn)染復合物的培養(yǎng)基,供后續(xù)實驗使用。實驗重復3次。

1.5 細胞增殖實驗

采用MTT法,取對數(shù)生長期的胃癌AGS細胞按5×103個/孔接種于96孔板,實驗分組同上,每組設(shè)置4個復孔;未接種細胞孔中加入RPMI 1640培養(yǎng)基作為調(diào)零孔,放置含有5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中,檢測miR-582-5p mimics本身對細胞增殖的影響,細胞貼壁后分別更換含不同濃度的Oxaliplatin(奧沙利鉑)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),換液后24,48,72,96 h各檢測1次,每孔加入MTT 20 μl繼續(xù)培養(yǎng)箱中孵育4 h用酶標儀檢測其490 nm處吸光值。實驗重復3次。

1.6 細胞周期檢測

取胃癌AGS細胞按照2×105個/孔接種于6孔板,實驗分組同上。轉(zhuǎn)染后24 h換成無血清培養(yǎng)24 h,然后再換成含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,用胰酶收集各組細胞,所收集細胞用預冷的PBS洗滌3次,1 000 r/min,5 min/次,棄上清。加入-20 ℃預冷的75%冰乙醇1 ml固定細胞,置于4 ℃冰箱過夜;檢測前離心(1 000 r/min,5 min),用PBS洗滌2次;加入100 μl PBS并將細胞吹懸;用含0.01% RNase和0.5%碘化丙啶(PI)4 ℃處理細胞20 min。過300目尼龍網(wǎng)。送流式細胞儀檢測。

1.7 Western blot檢測LGR5的表達水平

將AGS細胞按照2×105個/孔接種于6孔板中,分為實驗組、陰性對照組和空白對照組,收集轉(zhuǎn)染72 h的各組細胞,加入細胞裂解液,提取細胞總蛋白,BCA法檢測總蛋白濃度,每組樣本取10 μl進行10% SDS-PAGE垂直電泳,濕轉(zhuǎn)法將膠中蛋白水平轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂牛奶在37 ℃搖床上封閉1 h,加入TBST稀釋后的一抗,4 ℃過夜;取出后TBST洗膜3次再加入二抗,孵育1 h,再洗膜3次,添加ECL發(fā)光液反應底物,凝膠成像系統(tǒng)掃描,采用相關(guān)圖像分析軟件(Bio-rad Quantity One,CA)進行條帶灰度分析實驗采用GAPDH作為參照蛋白。

1.8 雙熒光素報告基因檢測

將AGS細胞按105個/孔接種于24孔培養(yǎng)板,用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng),使細胞融合率達到70%左右,將內(nèi)參質(zhì)粒Renilla、熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL3-LGR5-3′UTR以及miR-582-5p mimics共轉(zhuǎn)染,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,裂解細胞,利用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活性的變化。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析,兩組間比較采用兩樣本t檢驗,多組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA),P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌AGS細胞轉(zhuǎn)染miR-582-5p mimics后miR-582-5p的表達水平

與陰性對照組比較,實驗組miR-582-5p的表達水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而陰性對照組和空白對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖1)。

2.2 上調(diào)miR-582-5p對胃癌細胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示,與陰性對照組比較,轉(zhuǎn)染了miR-582-5p mimics的人胃癌細胞AGS,在轉(zhuǎn)染24,48 h生長速度差異沒有統(tǒng)計學意義(均P>0.05),但是在轉(zhuǎn)染72,96 h明顯抑制,隨著OD值減小,細胞增殖能力明顯降低(P<0.05,見圖2),而陰性對照組和空白對照組間沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結(jié)果表明上調(diào)miR-582-5p具有抑制胃癌細胞增殖的作用。

與其余兩組比較,*P<0.05圖1 Real-time PCR驗證實驗組轉(zhuǎn)染效率Figure 1 miR-582-5p mimics transfection efficiency verified by real-time PCR

與其余兩組比較,*P<0.05圖2 MTT法檢測上調(diào)miR-582-5p對胃癌細胞增殖的影響Figure 2 The proliferation ability of up-regulation of miR-582-5p in AGS cells by MTT

2.3 上調(diào)miR-582-5p對胃癌細胞周期的影響

流式細胞儀檢測結(jié)果見圖3。相對于陰性對照組,實驗組人胃癌細胞AGS中G0/G1期細胞比例明顯增多(61.6%±1.32%vs50.87%±2.77%,P<0.05),S期細胞比例減少(21.93%±1.49%vs30.03%±1.71%,P<0.05),G2/M期細胞比例無統(tǒng)計學差異(11.03%±0.61%vs11.61%±0.88%,P>0.05),而陰性對照組和空白對照組間沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)果表明上調(diào)miR-582-5p具有抑制胃癌細胞G1/S轉(zhuǎn)化的作用。

2.4 上調(diào)miR-582-5p對胃癌細胞耐藥性的影響

細胞計數(shù)實驗顯示,藥物維持時間在48 h,隨著奧沙利鉑濃度增高(1,2,4μg/ml),相比空白對照組,實驗組AGS細胞轉(zhuǎn)染miR-582-5p mimics以后對奧沙利鉑的敏感性增加,生長明顯抑制,差異具有統(tǒng)計學意義(見圖4A)。在2 μg/ml和4 μg/ml濃度時,空白對照組和陰性對照組細胞活力無明顯差異,所以選擇濃度較低的2 μg/ml進行后續(xù)試驗,奧沙利鉑濃度維持在2 μg/ml,隨著藥物維持時間增加(24,48,72 h),相比陰性對照組,實驗組AGS對奧沙利鉑敏感性增加,生長明顯抑制,差異具有統(tǒng)計學意義(見圖4B)。上述結(jié)果表明,上調(diào)miR-582-5p具有增加胃癌細胞對奧沙利鉑的敏感性,降低耐藥性。

圖3 流式細胞儀法檢測上調(diào)miR-582-5p對胃癌細胞周期的影響Figure 3 Effect of up-regulation of miR-582-5p in AGS cells by FCM

A.隨著奧沙利鉑濃度增加,miR-582-5p mimics敏感性增強B.2 μg/ml奧沙利鉑在不同時間對各組細胞活力的影響與其余各組比較,*P<0.05圖4 MTT法檢測上調(diào)miR-582-5p對胃癌細胞化療耐藥性的影響Figure 4 Chemotherapy resistance of drugs to AGS cells after up-regulation of miR-582-5p by MTT

2.5 miR-582-5p調(diào)控的靶基因并驗證

通過靶基因預測軟件PicTar、TargetScan和microRNA.org預測并分析,LGR5基因可能是miR-582-5p的靶基因之一。雙熒光素報告基因檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-582-5p mimics后,含有LGR5基因3′UTR的熒光素酶活性受到明顯抑制(P<0.05,見圖5A)。Western bolt結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-582-5p mimics后,實驗組較陰性對照組和空白對照組LGR5的蛋白表達水平明顯受到抑制(0.41±0.38vs0.91±0.08,1.01±0.02,見圖5B、5C),差異有統(tǒng)計學意義,而LGR5的mRNA表達水平?jīng)]有統(tǒng)計學差異(見圖5D)。

與其他兩組比較,*P<0.05圖5 預測miR-582-5p調(diào)控的靶基因并驗證Figure 5 Prediction of miR-582-5p regulatory target genes and verification

2.6 上調(diào)miR-582-5p對Wnt/β-catenin下游相關(guān)靶基因的影響

與陰性對照組比較,實驗組的AGS細胞cyclinD1,c-myc,survivin、MDR1表達明顯降低(均P<0.05)。陰性對照組和空白對照組之間比較差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖6)。

3 討論

大量的研究表明,多種腫瘤中miRNA的高表達或低表達,miRNA可能扮演原癌基因和抑癌基因的角色[6]。根據(jù)既往研究,在胃癌中多種miRNA異常表達,提示在胃癌的發(fā)生發(fā)展中miRNA的表達差異性是普遍的現(xiàn)象,miRNA的異常表達與胃癌細胞增殖活性、藥物敏感性和侵襲遷移能力密切相關(guān)[7]。miR-582-5p已被證實在人的多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。本課題組前期的工作表明miR-582在胃癌中低表達[8],但是關(guān)于miR-582-5p在胃癌中的作用的機制研究至今少有報道。

LGR5是G蛋白偶聯(lián)受體家族成員之一,已經(jīng)被認為是小腸、結(jié)腸[9]和毛囊[10]的干細胞標志之一。有文獻報道在許多實體腫瘤中檢測到LGR5表達增高,如肺癌[11]、結(jié)直腸癌[12]、卵巢癌[13]和基底細胞癌[14]等,高表達LGR5與腫瘤發(fā)生、侵襲和遷移有關(guān),提示LGR5可能在腫瘤形成過程中發(fā)揮作用。Wnt信號通路作為一個高度保守的系統(tǒng),在調(diào)節(jié)干細胞和腫瘤方面發(fā)揮重要作用,其異常激活往往與腫瘤形成相關(guān)[15]。越來越多研究結(jié)果表明LGR5參與到Wnt/β-catenin信號通路中[16],通過募集結(jié)合了Wnt配體的LRP-Frizzled受體復合物從而導致LRP的磷酸化和下游一系列分子的激活,包括β-catenin的聚集,轉(zhuǎn)入核,與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子協(xié)調(diào)激活相關(guān)基因的表達,如cylinD1、c-myc、survivin、MDR1等[16]。

圖6 Western blot檢測上調(diào)miR-582-5p對Wnt/β-catenin下游相關(guān)靶基因的影響Figure 6 The effects of up-regulation of miR-582-5p on downstream target of Wnt/β-catenin by Western blot

本研究得出LGR5可能作為miR-582-5p在胃癌細胞的靶基因之一,上調(diào)miR-582-5p能夠通過降低LGR5的表達而抑制胃癌細胞的增殖和周期,降低細胞對奧沙利鉑的耐藥性。因此,本研究提示miR-582-5p在胃癌的腫瘤形成過程中扮演著抑癌基因的角色。其他腫瘤的相關(guān)研究報道,miRNA-582-5p在肝癌組織和肝癌細胞系的表達降低,上調(diào)miR-582-5p能抑制肝癌細胞的生長,能直接靶向CDK1和AKT3且間接抑制cyclinD1來調(diào)節(jié)肝癌的進程[18]。在膀胱癌中利用miR-582-5p通過靶向PGGT1B、LRRK2和DIXDC1相關(guān)基因的機制實現(xiàn)腫瘤的治療效應[3]。在人前列腺癌細胞和腦膠質(zhì)瘤細胞中miR-582-5p表達上調(diào)且促進細胞增殖,在去勢抵抗前列腺癌異體移植模型中miR-582-5p靶向下調(diào)增殖相關(guān)基因EFNB2[19],而膠質(zhì)瘤中靶向下調(diào)凋亡相關(guān)基因caspase 3、caspase 9和Bim[20]。在人結(jié)直腸癌細胞中,miR-582-5p上調(diào)并通過靶向Rab27a[21]來抑制細胞周期,同時存在靶向APC來促進細胞增殖[22]的不一致的研究結(jié)果。在此,本研究得出miR-582-5p通過LGR5調(diào)控Wnt通路,導致cyclinD1,c-myc,survivin和MDR1蛋白表達下調(diào),從而抑制胃癌細胞的增殖和周期,導致細胞的耐藥。

綜上所述,上調(diào)miR-582-5p能夠抑制胃癌細胞的增殖活性和細胞周期,增加胃癌細胞化療藥物敏感性,預測其在胃癌中可能扮演致抑癌基因的角色,可能通過靶基因LGR5發(fā)揮生物學功能。

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