楊 婧 ，郭楚玲 ，2，3*，劉沙沙 ，黨 志 ，2，盧桂寧 ，2

（1.華南理工大學(xué)環(huán)境與能源學(xué)院，廣州 510006；2.工業(yè)聚集區(qū)污染控制與生態(tài)修復(fù)教育部重點實驗室，廣州 510006；3.廣東省環(huán)境風(fēng)險防控與應(yīng)急處置工程技術(shù)研究中心，廣州 510006）

鄰苯二甲酸酯（簡稱PAEs）是工業(yè)常用塑化劑，廣泛應(yīng)用于建筑裝飾、化妝品、食品包裝和醫(yī)療用具等領(lǐng)域[1]。由于PAEs與塑料樹脂等并不是以穩(wěn)定的化學(xué)鍵結(jié)合[2-3]，且其在環(huán)境中不易分解，因此極易在塑料的生產(chǎn)和使用過程中釋放進(jìn)入土壤[4]、水和沉積物[5-6]、大氣[7]，甚至室內(nèi)環(huán)境中[8]，并可通過食物鏈進(jìn)入人體[9]，對人體造成極大危害[10]。我國環(huán)境污染中比較常見且難以降解的PAEs主要為鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）和鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）[11-13]，這 3種PAEs均被美國環(huán)境保護(hù)署和中國國家環(huán)境監(jiān)測中心列入優(yōu)先控制污染物黑名單[1，14]。

PAEs屬于持久性有機(jī)污染物，在自然環(huán)境中的光解和水解速率相當(dāng)緩慢，而生物降解被認(rèn)為是環(huán)境中PAEs的主要降解途徑[13]，從而被廣泛研究[15-16]。目前，國內(nèi)外有大量學(xué)者從不同環(huán)境介質(zhì)中，如沉積物[17]、活性污泥[18]、污染土壤[19]等篩選 PAEs 降解菌，研究菌株降解特性、底物廣譜性、推測PAEs代謝途徑等。已報道的PAEs降解菌主要有：假單胞菌（Pseudomonas sp.）[9]、戈登氏菌（Gordonia sp.）[20-21]、壤霉菌（Agromyces sp.）[22]、不動桿菌（Acinetobacter sp.）[23]、紅球菌（Rhodococcus sp.）[19，24]等。而近年來，隨著農(nóng)用塑料薄膜的廣泛應(yīng)用，越來越多的PAEs被釋放進(jìn)入農(nóng)田土壤中[4]，甚至有些典型膜覆蓋農(nóng)田土壤中PAEs總含量高達(dá)33.36 mg·kg-1，其中DEHP含量達(dá)21.31 mg·kg-1，遠(yuǎn)高于美國土壤PAEs化合物控制標(biāo)準(zhǔn)（DEHP 為 4.35 mg·kg-1）[25]。有研究表明，將 PAEs降解菌添加到污染土壤中可大幅提高土壤中PAEs的降解速率[14，19，26]。而DEHP的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜且疏水性強(qiáng)，相比于DMP和DBP更難降解[27]，因此，篩選出環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)且有潛力運用到污染土壤修復(fù)中的DEHP高效降解菌具有一定的研究意義。

本研究從廣州市瀝滘污水處理廠活性污泥中分離篩選出一株DEHP高效降解菌。采用16SrRNA序列分析技術(shù)對菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并研究菌株對DEHP的降解特性。通過GC-MS檢測DEHP降解的中間產(chǎn)物，推測其降解途徑。最后將ASW6D應(yīng)用到DEHP污染土壤中，研究其對土壤中DEHP的去除效果，為實際污染土壤的生物修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

活性污泥取自廣東省廣州市瀝滘污水處理廠二沉池。

化學(xué)試劑：DMP、DBP和DEHP購自Sigma-Aldrich Co.LLC.（中國上海），純度>99%。實驗中其他化學(xué)試劑均為分析純，所有溶劑均為高效液相色譜（HPLC）級。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基（MSM）：NaCl（0.75 g·L-1）、NH4NO3（0.5 g·L-1）、FeCl3（0.001 g·L-1）、K2HPO4·3H2O（1 g·L-1）、MgSO4·7H2O（0.4 g·L-1）、CaCl2（1.9 g·L-1），初始pH為7.5~8.0。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）：蛋白胨（10 g·L-1）、牛肉提取物（3 g·L-1）、氯化鈉（5 g·L-1），pH 為 7.2~7.6。

1.2 實驗方法

1.2.1 DEHP高效降解菌的馴化與分離

將新鮮活性污泥25 mL置于250 mL錐形瓶中，加入 75 mL MSM，投加 PAEs混合液（DMP、DBP和DEHP濃度相同）作為碳源，在 30℃、150 r·min-1搖床中振蕩培養(yǎng)7 d，然后將25 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中，并在相同條件下培養(yǎng)。PAEs投加濃度為35、70、105、140 mg·L-1，4 周遞增一次，共馴化 16 周，得到對PAEs有穩(wěn)定降解能力的菌液。通過稀釋涂布平板法在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上對菌液進(jìn)行篩選，勾取長勢良好的單菌落到新鮮MSM中，如此反復(fù)直至分離到一株P(guān)AEs高效降解菌，命名為ASW6D。將0.5 mL DEHP（20 g·L-1）甲醇溶液加入 250 mL 錐形瓶中，待甲醇揮發(fā)后，加入10 mLASW6D菌液與90 mLMSM，30℃、150 r·min-1搖床中振蕩培養(yǎng)7 d，連續(xù)轉(zhuǎn)接4次得到ASW6D穩(wěn)定培養(yǎng)液。

1.2.2 菌株ASW6D的形態(tài)觀察與鑒定

采用平板劃線法將ASW6D接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，30℃下培養(yǎng)3 d，觀察菌落特征。使用場發(fā)射掃描電鏡Merlin對菌株ASW6D的表面形態(tài)進(jìn)行觀察。菌株的16SrRNA序列測定委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成，并用MEGA 6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌懸液的制備

將 100 mL 培養(yǎng)液 4000 r·min-1離心 5 min，并用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，0.1 mol·L-1、pH7.8）洗滌 3次，然后將洗滌液重懸于PBS中并使用紫外分光光度計（UV-2550，Shimadzu，日本）在 600 nm 測量菌懸液吸光度，利用PBS將OD600調(diào)至0.3作為后續(xù)實驗的接種物。

1.2.4 DEHP降解菌降解特性的研究

采用批量平衡試驗，測定菌株ASW6D的生長曲線及其降解DEHP的動力學(xué)曲線。將2 mL菌懸液接種至18 mL MSM中，DEHP初始濃度為100 mg·L-1，150 r·min-1、30 ℃下避光振蕩培養(yǎng)。在 6、12、24、36、48、72、96、144 h 時取樣，測定溶液 OD600與 DEHP 的剩余量。為研究菌株對DEHP的降解能力以及環(huán)境因素（DEHP初始濃度為100 mg·L-1）對其降解能力的影響，本研究采用單因素實驗，按照上述同樣的接種培養(yǎng)方式在初始 DEHP 濃度（35~1000 mg·L-1），溫度（10、20、30、40 ℃），初始 pH（4、5、6、7、8、9、10、11）下培養(yǎng)3 d后測定溶液OD600與DEHP剩余量，同時設(shè)置不接菌作為空白處理組。為研究菌株ASW6D的底物廣譜性，分別選擇兩種環(huán)境中常見的PAEs（DMP與DBP）作為唯一碳源進(jìn)行實驗，DMP、DBP初始濃度均為35 mg·L-1，接種培養(yǎng)方式同上。

利用高效液相色譜（Agilent 1260 series）檢測溶液中3種PAEs，采用外標(biāo)法對3種PAEs定量，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線（所有R2均在0.999以上）。前處理方法（回收率在85.71%~109.69%之間）：在含有20 mL菌液的100 mL錐形燒瓶中，加入20 mL甲醇，超聲溶解30 min，提取2 mL溶液過0.22μm微孔過濾膜，后轉(zhuǎn)入色譜瓶待測。色譜條件：色譜柱為Agilent Ecliose XDBC18（150 mm×4.6 mm×2.5μm），流動相為甲醇∶水=90∶10，進(jìn)樣量20μL，柱溫30℃，UV檢測波長為224 nm。

1.2.5 DEHP降解產(chǎn)物的檢測

將2 mL菌懸液接種至18 mL MSM中，DEHP初始濃度為 100 mg·L-1，于 0、12、24、36 h 時取樣，用GC-MS（Trace DSQ，Thermo）檢測 DEHP 代謝產(chǎn)物。前處理方法：將20 mL乙酸乙酯加入到液體培養(yǎng)物中，超聲提取10 min后，在2250 r·min-1下離心5 min，提取上層有機(jī)相，重復(fù)上述過程兩次。將有機(jī)相收集一起后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)接近干燥，后溶解于2 mL正己烷中，過0.22μm濾膜，將最終溶液轉(zhuǎn)移至色譜瓶中待測，色譜條件同Tang等[16]研究。質(zhì)譜鑒定的結(jié)果與美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所（NIST，Gaithersburg，MD）數(shù)據(jù)庫的標(biāo)準(zhǔn)化合物進(jìn)行比對。

1.2.6 高效降解菌在DEHP污染土壤中的應(yīng)用

供試土壤采自廣州市穗石村未污染農(nóng)田土壤，土壤質(zhì)地為壤土（砂粒54%、粉粒38%、黏粒8%），pH為 6.53，總有機(jī)碳 3.78 g·kg-1，總氮 0.31 g·kg-1，總磷0.25 g·kg-1。為了研究降解菌對DEHP污染土壤的修復(fù)潛力，以及土著微生物對其降解效果的影響，試驗分別設(shè)置土壤未滅菌組與滅菌組。未滅菌組：將100 g土壤（過2 mm篩）置于250 mL錐形燒瓶中，加入DEHP丙酮溶液，調(diào)節(jié)最終濃度為100 mg·kg-1。充分混合后，溶劑蒸發(fā)24 h。然后將菌懸液均勻地接種到土壤中，最終濃度為1×107CFU·g-1。滅菌組：將土壤樣品在121℃下高壓滅菌1 h，后接種菌懸液，在（30±0.5）℃下避光培養(yǎng)。通過添加無菌水使土壤含水量保持在50%。每隔1 d收集土壤樣品1 g，通過GC-MS（Trace DSQ，Thermo）測定土壤中殘留的DEHP濃度。滅菌與未滅菌組均分別設(shè)置空白組。

土壤樣品前處理方法：將1.0 g土壤加入玻璃離心瓶中，加入 20 mL 丙酮和己烷（1∶1，V/V）混合液，超聲提取10 min，2250 r·min-1離心5 min。重復(fù)以上步驟兩次。收集有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)接近干燥，后溶于10 mL正己烷中。提取2 mL溶液過0.22μm微孔濾膜后轉(zhuǎn)移至色譜瓶待測，檢測方法同1.2.5所示。

2 結(jié)果與討論

2.1 DEHP高效降解菌的分離與鑒定

菌株ASW6D在平板上呈乳白色、表面干燥、邊緣不整齊、粗糙型菌落（圖1a），電鏡圖上顯示其細(xì)胞形態(tài)成桿狀，稍有彎曲（圖1b）。PCR擴(kuò)增16SrRNA基因（1477 bp），GenBank 登錄號為 KY888692，基于序列在NCBI上的比對結(jié)果，菌株ASW6D與Mycobacterium mucogenicum（NR_042919.1）有很高的相似性（99%）。用MEGA 6.06軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2，圖中ASW6D與Mycobacterium mucogenicum和Mycobacterium sp.親緣關(guān)系最近，由此推斷菌株ASW6D屬于分枝桿菌屬（Mycobacterium sp.）。已有文獻(xiàn)報道Mycobacterium sp.可以降解PAEs[28]，但更多的是研究其對多環(huán)芳烴的降解[29-30]。

圖1 菌株ASW6D的形態(tài)特征Figure 1 Morphological properties of the colonies of strain ASW6D（a）coloby（b）cell imageof SEM

2.2 菌株ASW6D對DEHP降解能力的研究

ASW6D可以將DEHP作為唯一碳源迅速生長，生長延滯期很短，6 h時開始進(jìn)入對數(shù)期，24 h時OD值達(dá)到最高，同時 DEHP（100 mg·L-1）的去除率達(dá)89.34%，隨后逐漸進(jìn)入衰退期，DEHP最終基本被降解完（1.41%）（圖3）。為進(jìn)一步研究菌株ASW6D對DEHP的降解能力，采用不同初始濃度（35~1000 mg·L-1）的DEHP作為唯一的碳源。實驗結(jié)果顯示（圖4），當(dāng)DEHP濃度不高于500 mg·L-1時，3 d內(nèi)降解率可達(dá)80%以上，當(dāng)DEHP濃度增加至1000 mg·L-1時，降解率降低至30.44%。已有的報道中，分枝桿菌YCRL4 培養(yǎng) 24 h 后對 DEHP（50 mg·L-1）去除率不到50%[28]，Pesudomonas sp.XB[18]和 Acinetobacter sp.SN13[23]培養(yǎng) 24 h 后對 DEHP（100 mg·L-1）的去除率分別為70%和40%。相比較以上幾種菌株，ASW6D對DEHP具有更好的降解效果。

圖2 菌株ASW6D系統(tǒng)發(fā)育樹Figure2 Phylogenetic tree of strain ASW6D

圖3 菌株ASW6D利用DEHP（100 mg·L-1）的生長降解曲線Figure 3 The DEHP（100 mg·L-1）degradation curve and the growth curve of strain ASW6D

圖4 不同DEHP初始濃度對DEHP降解的影響Figure 4 Effectsof different initial DEHPconcentrationson DEHPbiodegradation

圖5 溫度對菌株ASW6D降解DEHP的影響Figure 5 Effects of temperature on DEHPdegradation by ASW6D

2.3 溫度和pH對DEHP降解的影響

微生物主要通過分泌相關(guān)酶來分解有機(jī)物，溫度和pH會影響酶的活性，從而影響微生物的生長與對有機(jī)物的降解能力[31]。從圖5和圖6可看出，菌株ASW6D在10℃和pH 11條件下僅有些許生長，而在20~40℃條件下，DEHP 3 d內(nèi)的降解率可達(dá)85%以上；在pH 5~10條件下，降解率均大于77%。其中當(dāng)溫度為30℃和pH為8時，DEHP降解率高達(dá)98%以上，同時OD600值也達(dá)到0.33以上。由此可看出ASW6D的最適溫度和pH值分別為30℃和8。

據(jù)文獻(xiàn)報道，Mycobacterium sp.YC-RL4可在20~40 ℃、pH 7~9 下高效降解 DEHP[28]，Acinetobacter sp.SN13的適宜溫度和pH范圍為25~35℃和6~9[23]，Gordonia sp.HS-NH1的則為30℃和7~8[21]。對比以上菌株，ASW6D能夠在相當(dāng)寬的溫度（20~40℃）和pH（5~10）范圍下高效降解DEHP，更適合應(yīng)用于污染環(huán)境的生物修復(fù)。

圖6 pH對菌株ASW6D降解DEHP的影響Figure 6 Effects of pH on DEHPdegradation by ASW6D

2.4 菌株ASW6D對DMP和DBP的降解

菌株ASW6D在DMP、DBP初始濃度為35 mg·L-1時的降解曲線如圖7所示，24 h時，ASW6D對DMP和DBP去除率為86.64%。對比上文DEHP的降解曲線，高效降解菌ASW6D可以快速利用短鏈PAEs——DMP，而對于中鏈PAEs——DBP和長鏈PAEs——DEHP的降解速度則相對較慢，該結(jié)果與先前的報道很接近[32-33]。我國環(huán)境污染中的酞酸酯主要為DMP、DBP和DEHP[11-13，34]，而菌株ASW6D不僅可以高效降解DEHP，還可快速降解DMP和DBP。由此可見，ASW6D在PAEs污染環(huán)境的實際修復(fù)中具有一定的優(yōu)勢。

2.5 DEHP降解產(chǎn)物的檢測與代謝路徑的推測

為推測ASW6D對DEHP的降解途徑，分別檢測降解過程中在 0、12、24、36 h DEHP 的降解產(chǎn)物。DEHP降解過程中主要檢測出3種物質(zhì)（圖8），通過與譜庫（圖9中d~f）的比對可以確定3種物質(zhì)分別為DEHP、DBP和PA。剛開始只檢測到DEHP，而在12、24、36 h時DEHP的含量逐漸降低，同時開始檢測到DBP和PA，由此可推斷出ASW6D降解DEHP的主要中間產(chǎn)物為DBP和PA。

常見的DEHP生物降解過程主要是通過酯的水解作用，將DEHP轉(zhuǎn)化為鄰苯二甲酸單-2-乙基己酯（MEHP），通過水解酶進(jìn)一步水解為PA，最終為PA的礦化過程[3，22，28，35-36]，很少有文獻(xiàn)報道其降解過程中會產(chǎn)生中間產(chǎn)物DBP。根據(jù)GC-MS的檢測結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)，推測ASW6D作用下DEHP的生物降解過程為：先通過β-氧化逐漸縮短DEHP側(cè)鏈，生成DBP，DBP可能會繼續(xù)通過β-氧化縮短側(cè)鏈生成短鏈PAEs，然后再水解生成PA，也可能先通過水解作用脫一條側(cè)鏈，生成鄰苯二甲酸單丁酯（MBP），再繼續(xù)水解生成PA，接著PA氧化開環(huán)，最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)生成 CO2和 H2O（圖9），這一降解途徑與菌株LMB-1降解DBP和JDC-32降解鄰苯二甲酸二辛酯（DOP）的途徑很類似[16，37]。

圖7 ASW6D對DMP、DBP的降解曲線Figure7 The DMPand DBPdegradation curvefor thestrain ASW6D

圖8 ASW6D降解DEHP過程中中間產(chǎn)物的色譜圖Figure8 Chromatogramsof the intermediates of DEHP degradation by ASW6D

2.6 菌株ASW6D在DEHP污染土壤中的應(yīng)用

為進(jìn)一步研究ASW6D在DEHP污染環(huán)境中的降解能力，以及土著微生物對其降解性能的影響，將ASW6D分別接種到滅菌和未滅菌土壤中，分析DEHP降解情況。接種ASW6D到未滅菌土壤18 d后，DEHP去除率為75.12%，空白組為16.45%；接種ASW6D到滅菌土壤18 d后，DEHP去除率為85.08%，空白僅去除7.54%，ASW6D的添加將DEHP去除率提高了77.54%（圖10）。動力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明DEHP降解過程基本符合一級動力學(xué)模型（R2=0.7674~0.976 8）（表1）。土壤滅菌處理下，接種ASW6D后DEHP 的半衰期（t1/2）為 5.03 d，對照組為 71.97 d，在土壤未滅菌情況下，添加ASW6D的t1/2為6.67 d，而對照組為33.43 d（表1）。結(jié)果表明，添加菌株ASW6D可大幅降低（P＜0.05）DEHP在土壤中的半衰期，加快DEHP的降解速率。秦華等[26]分別添加3種菌懸液到污染土壤（DEHP 濃度為 100 mg·kg-1）中，3 種處理下DEHP半衰期為24~35 d；加入降解菌群到PAEs混合污染土壤中，30 d后DEHP的同分異構(gòu)體DOP（100 mg·kg-1）去除率不到 50%，DOP 半衰期為 28 d[38]。本研究中，外加ASW6D到DEHP污染的土壤，DEHP的半衰期為6.67 d，表明ASW6D具有較高的降解潛力。

圖9 ASW6D降解DEHP過程中中間產(chǎn)物的質(zhì)譜圖Figure 9 Spectra of theintermediatesof DEHPdegradation by ASW6D

圖10 ASW6D對污染土壤中DEHP的降解Figure 10 Degradation of DEHPby ASW6Din containment soil

表1 ASW6D降解污染土壤中DEHP的動力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parametersof DEHPdegradation in contaminated soils by ASW6D

添加菌株ASW6D的未滅菌土壤組DEHP的降解曲線在8 d內(nèi)相對滅菌組較平緩，降解速率較慢（圖10）。而在8~18 d內(nèi)，未滅菌土壤組的降解速率迅速加快，并逐漸超過滅菌組。該結(jié)果可能是由于菌株ASW6D與土壤中土著微生物存在某種競爭關(guān)系，所以在前8 d ASW6D的生長受到一定影響，導(dǎo)致DEHP的降解曲線比較平緩，而8 d后速率突然加快可能是由于菌株ASW6D在與土著微生物的競爭中逐漸占據(jù)優(yōu)勢，從而加快了對DEHP的降解。

綜上所述，菌株ASW6D可快速去除新加入土壤的DEHP，具有高效降解DEHP的能力，表明菌株ASW6D對PAEs污染環(huán)境的生物修復(fù)具有一定的潛力與應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

（1）獲得了一株可高效降解DEHP的菌株ASW6D，經(jīng)形態(tài)學(xué)特征和16SrRNA序列分析，初步鑒定為分枝桿菌屬（Mycobacterium sp.）。

（2）ASW6D可在較寬溫度（20~40℃）和pH（5~10）范圍下高效降解DEHP。DEHP生物降解過程中檢測到的主要代謝物是DBP和PA。

（3）添加菌株ASW6D到DEHP污染的土壤，可明顯提高DEHP的去除率，表明ASW6D在PAEs污染環(huán)境的生物修復(fù)方面具有一定的潛力。

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