賈冰凝 何微 岳苑 吳明 張慧玲

摘 要：根據(jù)狐貍線粒體DNA（mtDNA）序列設(shè)計了狐貍特異性引物和探針，建立了食品中狐貍源性成分的實時熒光PCR檢測方法。該方法的檢測靈敏度可達0.1pg，而且與常見的12個物種無交叉反應(yīng)，可作為食品中狐貍源性成分鑒別的有效方法。

關(guān)鍵詞：實時熒光PCR 狐貍源性 線粒體DNA 清真食品

中圖分類號：TS207 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2017）12（c）-0109-03

我國少數(shù)民族眾多，遍布各個省份，其中回族、維吾爾族、哈薩克族等少數(shù)民族信奉伊斯蘭教。他們在飲食、起居等方面形成了獨具特色的風俗習慣，尤其在飲食方面有著嚴格的宗教特色禁忌，禁食奇形怪狀、污穢不潔、性情兇惡、行為怪異的飛禽、猛獸及魚類等食物以及不反芻的動物，如豬、狗、貓、鼠、蛇、驢、馬、騾、狗、狐貍等[1]。

狐貍作為一種經(jīng)濟附加值很高的畜類，在中國廣泛養(yǎng)殖，人們主要通過飼養(yǎng)狐貍獲取其皮毛制作衣服、圍巾等產(chǎn)品。在將狐貍剝?nèi)テず?，剩余的肉及?nèi)臟就成為了“廢物”，一些不法商販將廢肉低價買入再將其送往食品加工廠做成牛肉、羊肉、狗肉等制品并高價賣出，從中獲得暴利。由于狐貍?cè)鉀]有通過檢驗檢疫，帶有大量的病毒、細菌、寄生蟲，而且為了得到光澤好的高質(zhì)量的皮毛，養(yǎng)殖戶會給狐貍喂食激素。這不僅僅是食品安全問題，更涉及到人們身體健康和宗教信仰等問題[1]。因此，對于肉制品中摻假的檢測顯得尤其重要。

動物源性檢測手段主要有蛋白分析法和核酸分析法，但由于蛋白分析法要求樣品不能經(jīng)過高溫等能使蛋白變性的烹飪手段，這就極大地限制了其在實際生活中的應(yīng)用[1]。隨著分子生物學的進步，PCR技術(shù)很好地解決了這一問題。實時定量熒光PCR可以實時檢測目標片段的表達情況，是目前檢測食品中動物源性成分的主要手段，它有著專一性強、對樣品加工程度要求低等特點[2]。目前已有關(guān)于豬、牛、羊、馬、驢、兔[4-5]動物源性成分分析的報道，但采用實時定量熒光PCR法檢測清真食品中狐貍源性還鮮有報道。本實驗選擇狐貍線粒體設(shè)計引物和探針，建立快速準確地檢測清真食品中狐貍源性成分的實時定量熒光PCR檢測方法，給食品摻假檢測以及規(guī)范清真食品市場提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及來源

肉及其制品包括牛、羊、豬、魚、雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉、驢、馬、狗、狐貍。豬、牛、羊、魚、雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉采購自超市，驢、馬采購自餐館，狐貍采購自銀川市西夏區(qū)兆群狐貍養(yǎng)殖合作社，犬血液購自銀川市興慶區(qū)寵康動物診所。

1.1.2 實驗試劑

基因組DNA提取試劑盒購自于大連TAKARA公司； PCR擴增純化試劑盒，購自于Promager公司。

1.1.3 實驗儀器

實時熒光定量PCR儀（Eppendorf公司）；高速冷凍離心機（日本HTACHI公司）；恒溫加熱器（HAITEC公司）。

1.1.4 引物及探針的設(shè)計

根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫中公布的基因數(shù)據(jù)，選擇狐貍細胞色素b基因[3]，在線粒體DNA的區(qū)域設(shè)計了用于檢測狐貍DNA的特異性引物和探針，此外，為了防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn)以及監(jiān)控PCR反應(yīng)的正常與否，在真核生物的16sRNA保守區(qū)域設(shè)計了通用上下游引物。引物及探針的序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA的提取

采用TAKARA公司基因組DNA提取試劑盒，具體步驟：

（1）稱取10mg樣品加入Ep管中，充分剪碎；（2）70℃加熱10min，其間指彈2～3次；（3）12000rpm、4℃離心10min，取200μL上清于新離心管中備用。陰性樣品同樣通過該法提取DNA，溶解于100μL TE溶液中備用。

1.2.2 實時熒光PCR反應(yīng)

反應(yīng)體系40μL：PCR Mix25μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，探針（5μM）2μL，模板DNA（10～50ng）2μL，無菌水補至40μL。

反應(yīng)條件為：50℃保溫2min，95℃預變性2min，95℃變性15s、60℃延伸45s進行40個循環(huán)，同時擴增目標物和內(nèi)參。

1.2.3 特異性實驗

為了考察本研究特異性，取1.1中所有樣品的制作模板。根據(jù)1.2.2的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別擴增。通用引物同步擴增[5]。

1.2.4 靈敏度實驗

將狐貍DNA溶液稀釋至10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%，以含量不同的狐貍DNA樣品為模板，進行PCR反應(yīng)，用于確定方法的靈敏度。

1.2.5 重復性與穩(wěn)定性驗證

將狐貍DNA作為模板，按照1.2.2所述的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件進行擴增，同一模板進行7次擴增反應(yīng)，研究所建立體系的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 狐貍源性成分特異性分析

用設(shè)計的狐貍源性引物和探針分別對12種樣品的DNA進行實時熒光PCR，結(jié)果如表2所示，Ct值的平均值為15.16，其余物種均無擴增，由此可見本研究所設(shè)計的狐貍源性引物和探針特異性良好。

2.2 靈敏度試驗結(jié)果

用特異性的引物和探針，以狐貍DNA含量分別為10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%和0.00001%為模板擴增，結(jié)果見圖1和圖2。由圖1和圖2可知：當狐貍成分含量低至0.0001%時，仍能夠呈現(xiàn)S型擴增曲線并且Ct值<35，說明本方法可檢出10-4ng的DNA量，因此方法的靈敏度為0.1pg。在10%至0.00001%濃度范圍內(nèi)，建立Ct值-DNA含量的標準曲線，R2為0.996，線性相關(guān)度良好。

2.3 重復性與穩(wěn)定性試驗結(jié)果

狐貍源性成分重復性試驗結(jié)果Ct值見表3。經(jīng)統(tǒng)計學分析表明，實驗穩(wěn)定性和重復性良好，結(jié)果無顯著性差異。

3 討論與結(jié)論

3.1 目的基因的選擇

之所以會選擇線粒體細胞色素b，是因為狐貍的細胞色素b相對使用其余DNA片段作為物種鑒定的靶序列具有以下優(yōu)點：（1）細胞色素b具有廣泛的種內(nèi)和種間多樣性，比核DNA進化速度快，適于親緣相近物種的鑒別。（2）每個線粒體含2～6個環(huán)狀DNA，在數(shù)量上遠超過核DNA，適于加工樣品的分析。（3）細胞色素b在不同的物種中具有較高的變異性，特異性較強。

3.2 檢出限的確定

狐貍源性成分靈敏度試驗0.1%、0.01%含量檢測的Ct值均<35.0，但是為了區(qū)分偶然性和蓄意摻假，同時考慮檢測過程中的實際意義，將檢出限確定為0.1%。

參考文獻

[1] 岳苑.實時熒光PCR法檢測清真食品中馬、驢源性成分[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2014，53（22）：5519-5521.

[2] 陳茹，林志雄，劉琳琳.應(yīng)用PCR等核酸技術(shù)檢驗動物飼料中牛羊組織成分[J].中國獸醫(yī)科技，2001，31（9）：3-8.

[3] 曹際娟，盧行安，秦成，等.實時熒光PCR技術(shù)檢測肉骨粉中牛羊源性成分的方法[J].生物技術(shù)通訊，2002，13（2）：158-160.

[4] 楊寶華，宗卉.根據(jù)線粒體基因的特異性鑒別檢測飼料中的動物源性成分[J].科學試驗與研究，2000（5）：1-3.

[5] Wang Q，Zhang X，Zhang HY，et al.Identification of 12 animal species meat by T-RFLP on the 12S rRNA gene[J].Meat Science，2010，85（2）：265-269.