王軼凡 ， 孫秀蘭 ， 張銀志 ， 丁小霞

（1.食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫214122；4.中國農(nóng)業(yè)科學院 油料作物研究所，湖北 武漢430062）

玉米赤霉烯酮（zearalenone，Zen）是一種由禾谷鐮刀菌等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，學名為6-（10-羥基-6-氧基-十一碳烯基）β-雷鎖酸內(nèi)酯[1-2]。玉米赤霉烯酮是污染糧食谷物最廣泛的真菌毒素之一，其在大麥、燕麥、黑麥、高粱和小麥中的污染都有報道。由于玉米赤霉烯酮與17β-雌二醇（E2）在化學結(jié)構(gòu)上存在相似性，玉米赤霉烯酮及其衍生物在哺乳動物中會產(chǎn)生強類雌激素效應，從而導致體內(nèi)內(nèi)分泌紊亂[3-7]。

真菌毒素的脫毒方法主要有物理法、化學法和生物法。而臭氧作為一種強效的氧化劑，其降解黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素等真菌毒素已見諸報道[8-12]。臭氧處理真菌毒素污染的玉米、花生、大麥、小麥和其他谷物已經(jīng)開始得到初步應用。200 mg/min的臭氧經(jīng)過92 h處理黃曲霉毒素污染的玉米后，黃曲霉毒素降解超過95%[12]。

臭氧可以由電化學放電產(chǎn)生，具有高效快速、滲透能力強和自身降解產(chǎn)物無毒副作用的優(yōu)點。但是，經(jīng)臭氧處理后的真菌毒素降解產(chǎn)物的相關(guān)研究鮮有出現(xiàn)在國內(nèi)外研究中，因此作者研究了臭氧處理玉米赤霉烯酮后的降解產(chǎn)物，并對其降解產(chǎn)物進行了肝癌細胞毒性評價。同時通過超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜建立了檢測玉米赤霉烯酮、玉米赤霉烯酮主要臭氧降解產(chǎn)物和其生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物玉米赤霉烯醇的檢測方法，探究特定條件下臭氧處理污染谷物時玉米赤霉烯酮及其降解產(chǎn)物變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米粉：市售；玉米赤霉烯酮，α-玉米赤霉烯醇，β-玉米赤霉烯醇標準品：Sigma公司產(chǎn)品；臭氧發(fā)生器：佳環(huán)電器科技有限產(chǎn)品；MTN-2800w氮吹儀：天津奧特賽思儀器公司產(chǎn)品；AcquityTM超高效液相色譜儀和AcquityTMTQD串聯(lián)質(zhì)譜檢測器：美國Waters公司產(chǎn)品；超純水制備儀：美國Millipore公司產(chǎn)品。HepG2人肝癌細胞：中國科學院細胞庫產(chǎn)品；DMEM高糖培養(yǎng)基：Hyclone公司產(chǎn)品。胎牛血清（FBS）：Gibco 公司產(chǎn)品；CCK-8 試劑盒，碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品；Infinite 1000酶標儀：Tecan公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米赤霉烯酮的臭氧處理 在室溫下，將5mL的玉米赤霉烯酮溶液 （20μg/mL）通入60mL/min的臭氧1 min。將反應后的溶液通過UPLC-QTOF進行檢測。

質(zhì)譜檢測采用電噴霧電離正離子（ESI+）的離子化模式，具體參數(shù)如下：毛細血管電壓，3.5 kV；離子源溫度，100℃；脫溶劑氣溫度，300℃；脫溶劑氣流量，700 L/h。

1.2.2 HepG2人肝癌細胞培養(yǎng) HepG2肝癌細胞培養(yǎng)在含質(zhì)量分數(shù)10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃，體積分數(shù)5%CO2條件下恒溫培養(yǎng)，每2～3天按1∶3比例傳代。

1.2.3 CCK-8法測定HepG2肝癌細胞活力 取對數(shù)生長期的肝癌細胞，PBS洗3次，用胰蛋白酶消化適當時間后，用DMEM培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)整為1×106/mL。向96孔培養(yǎng)板中加入上述細胞懸液100μL，將培養(yǎng)板至于體積分數(shù)5%CO2、37℃下培養(yǎng)12h后取出，分別加入不同濃度的玉米赤霉烯酮及臭氧處理1、3、10 min后的玉米赤霉烯酮DMEM培養(yǎng)液各10 μL，每個設(shè)樣品置6個復孔。繼續(xù)在體積分數(shù)5%CO2、37℃下培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL。孵育2 h后，用酶聯(lián)檢測儀在450 nm波長下進行測定各孔光密度值，計算出HepG2人肝癌細胞的活力。

1.2.4 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定玉米赤霉烯酮及其降解產(chǎn)物 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱；梯度洗脫的流動相條件與1.21的流動相條件相同。離子化模式：電噴霧電離正離子模式（ESI+）和負離子模式（ESI-）。玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯酮（α-Zen）、β-玉米赤霉烯酮（β-Zen）和臭氧降解產(chǎn)物的質(zhì)譜條件列于表1。定量方法采用的是多反應監(jiān)測（MRM）模式。采集的數(shù)據(jù)通過MassLynx 4.1軟件進行加工處理。

1.2.5 標準儲備溶液的配置 Zen、α-Zen和β-Zen標準溶液：稱取適量Zen、α-Zen和β-Zen標準品，以色譜純乙腈溶解并配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標準儲備溶液，于2～8℃條件下保存。

通過制備型液相，將臭氧降解玉米赤霉烯酮產(chǎn)物中含量較多的Compound 2、Compound 4分離富集，經(jīng)凍干濃縮后獲得固體。再以色譜純乙腈溶解并配成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的溶液，于2～8℃條件下保存。

1.2.6 玉米赤霉烯酮污染玉米粉的臭氧處理 準確稱取5.00 g玉米赤霉烯酮污染的玉米粉，分別經(jīng)過 60 mL/min 的 臭 氧 處 理 0、5、15、30、45、60、90min。每份處理后的玉米粉置于50 mL離心管中，加入體積分數(shù)80%乙腈溶液20 mL，振蕩處理15 min后，取過濾后的濾液5 mL，加入三氯甲烷5 mL，振蕩1 min，避光靜置。待溶液分層后，保留下層。上層再加入1 mL的三氯甲烷，振蕩1 min后，靜置分層，保留下層。將兩次保留的下層溶液混合，經(jīng)氮氣吹干后，加入1 mL的體積分數(shù)80%乙腈溶液，過0.22 μm有機相濾膜后，等待檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 臭氧處理玉米赤霉烯酮

圖1顯示玉米赤霉烯酮標準溶液 （20 μg/mL）經(jīng)臭氧處理1 min后，經(jīng)液相檢測在保留時間5.905、7.323、9.035、9.312 min 分別產(chǎn)生了 4 種降解產(chǎn) 物 Compound 1、Compound 2、Compound 3 和Compound 4。同時，未經(jīng)臭氧處理時在9.104 min出峰的玉米赤霉烯酮被完全降解。McKenzie等人[16]在臭氧處理玉米赤霉烯酮15 s后并沒有發(fā)現(xiàn)任何液相色譜儀可檢測到降解產(chǎn)物。這可能是由于其臭氧濃度過高，或者玉米赤霉烯酮濃度過低，導致臭氧降解產(chǎn)物短時間內(nèi)被臭氧完全氧化。經(jīng)超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜檢測，玉米赤霉烯酮的 [M+H]+是 319.154 3 （m/z）， 而 Compound 1、Compound 2、Compound 3和 Compound 4的 [M+H]+分別是 335.184 1、351.190 7、321.186 8 和 367.175 3（m/z）（圖 2）。

圖1 20 μg/mL玉米赤霉烯酮臭氧處理前后的總離子色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of zearalenone standard solutions at 20 ppm in acetonitrile solution and treated by ozone for 1.0 min（inset）

圖2 玉米赤霉烯酮臭氧降解產(chǎn)物的Q-TOF質(zhì)譜圖Fig.2 UPLC Q-TOF MS spectrum of zearalenoneozonolytic products

2.2 玉米赤霉烯酮降解產(chǎn)物的細胞毒性實驗

玉米赤霉烯酮最先在生物體內(nèi)的肝臟進行初級代謝，且玉米赤霉烯酮對肝臟有損傷作用。因此選擇人肝癌細胞HepG2對玉米赤霉烯酮的降解產(chǎn)物進行細胞毒性探究。如圖3玉米赤霉烯酮對HepG2細胞增殖的抑制率呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，根據(jù)試驗中玉米赤霉烯酮染毒質(zhì)量濃度（0.1～50 μg/mL）對應的細胞增殖率，使用SPSS軟件進行分析，計算出玉米赤霉烯酮對HepG2細胞的半數(shù)抑制濃度IC50大約是10 μg/mL。以此IC50濃度作為后續(xù)細胞毒性實驗的濃度。將10 μg/mL的Zen溶液和臭氧處理1、3、10 min 的 10 μg/mL 的 Zen 溶液通過 CCK-8試劑盒來測定其對HepG2細胞增殖的抑制率。經(jīng)測定臭氧處理1、3 min后，溶液中檢測不到Zen，僅含Zen降解產(chǎn)物；處理10 min后，溶液中檢測不到Zen和Zen的降解產(chǎn)物。如圖3所示結(jié)果，與未加玉米赤霉烯酮的Control組相比，玉米赤霉烯酮臭氧處理時間0 min時，玉米赤霉烯酮對HepG2人肝癌細胞生長有顯著性抑制 （P＜0.05）。臭氧處理1 min和3 min組即玉米赤霉烯酮的臭氧降解產(chǎn)物，對人肝癌細胞生長有顯著性抑制，但相比于玉米赤霉烯酮臭氧處理0 min組，細胞活力顯著升高。臭氧處理10 min組即玉米赤霉烯酮臭氧降解產(chǎn)物也被氧化后，其對人肝癌細胞生長的影響沒有顯著性抑制 （P＞0.05）。這表明玉米赤霉烯酮經(jīng)臭氧處理后，臭氧降解產(chǎn)物對人肝癌細胞生長存在抑制影響，但低于玉米赤霉烯酮對肝癌細胞的抑制程度。因此臭氧處理污染谷物過程中，足夠的臭氧濃度和處理時間對于確保氧化玉米赤霉烯酮及其降解產(chǎn)物是必要的。

圖3 不同質(zhì)量濃度玉米赤霉烯酮對HepG2細胞活力的影響和玉米赤霉烯酮處理后對HepG2細胞活力的影響Fig.3 Dose-response curves fitting with logistic function of zearalenone on HepG2 cells and effects of zearalenone solutions treated with diverse levels of ozone on cell viability

2.3 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定玉米赤霉烯酮及其降解產(chǎn)物

經(jīng)過3種色譜柱的優(yōu)化ACQUITY UPLC HSS T3柱，ACQUITY UPLC BEH130C18柱和ACQUITY UPLC BEH Shield RP18柱，得出ACQUITY UPLC HSS T3 柱 對 Zen、Compound 2、Compound 4、α-Zen、β-Zen 分離效果最好。 通過對不同流動相配比的優(yōu)化，得出最佳梯度洗脫的程序如方法所示。針對單個分析物標準品溶液上機分析，得到目標分析物的質(zhì)荷比。在碰撞誘導解析電離模式下，優(yōu)化了各目標物的去簇電壓和碰撞電壓，獲得離子豐度較大的碎片離子為該目標物的裂解的主要碎片離子。表2為在ESI模式下，各目標物的主要碎片離子的質(zhì)荷比。圖4為超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜在MRM模式下的各目標物的選擇離子流圖。

表1 Zen、Compound 2、Compound 4、α-Zen 和 β-Zen 的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Analytes and polarity modes，MRM transitions，cone voltages and collision energies used for quantitation and confirmation of zearalenone and ozonolytic products

2.4 臭氧處理玉米赤霉烯酮污染的玉米粉

臭氧處理玉米赤霉烯酮污染的玉米粉后，經(jīng)提取，檢測出在臭氧處理玉米赤霉烯酮標準溶液相同的降解產(chǎn)物，Compound 2和Compound 4。并沒有發(fā)現(xiàn)玉米赤霉烯酮的初級代謝物α-Zen和β-Zen。臭氧處理玉米赤霉烯酮污染的玉米粉90 min后，玉米赤霉烯酮的降解率達到95.1%。圖6表明，未進行臭氧處理時，玉米粉中并沒有Compound 2和Compound 4，臭氧處理0～15 min時，隨著玉米赤霉烯酮的減少，Compound 2和Compound 4含量增加。隨著臭氧繼續(xù)處理，臭氧在氧化玉米赤霉烯酮的同時，繼續(xù)氧化降解產(chǎn)物Compound 2和Compound 4，因此，此后Compound 2和Compound 4持續(xù)減少。

圖4 Zen、Compound 2、Compound 4、α-Zen 和 β-Zen 的MRM圖譜Fig.4 MRM spectrums of Zen and Zen、Compound 2、Compound 4、α-Zen 和 β-Zen

圖5 玉米粉中臭氧降解玉米赤霉烯酮效果Fig.5 Changesofzearalenonewith theincreasing oxidative time in corn flour

圖6 玉米粉中玉米赤霉烯酮臭氧降解過程中降解產(chǎn)物的變化Fig.6 Changes of zearalenoneozonolytic products with the increasing oxidative time in corn flour

3 結(jié) 語

臭氧制備簡單，高效快捷方便，可能處理的玉米赤霉烯酮污染的糧食或者飼料規(guī)模較大。因此，足夠的臭氧濃度或臭氧處理時間來降解玉米赤霉烯酮及其降解產(chǎn)物，有助于徹底解決臭氧處理玉米赤霉烯酮過程中，其中間產(chǎn)物依然存在毒性的問題。

作者建立的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測玉米赤霉烯酮及其降解產(chǎn)物的方法，在臭氧處理玉米赤霉烯酮污染實際谷物和飼料過程中，能夠簡便快速靈敏準確檢測出玉米赤霉烯酮及其降解產(chǎn)物的含量，為實際脫毒生產(chǎn)中臭氧的用量提供參考。

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