黎穎茵， 孫 浩， 左兆瑞， 毛紅菊， 錢大宏

0 引 言

癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)濃度可以作為良性與惡性腫瘤的鑒別依據(jù)[1～5]。臨床上常用的檢測手段中[6～8]，酶聯(lián)免疫吸附法檢測靈敏度低，而其他方法雖然檢測靈敏度高，但需要特殊的儀器設備，成本高，難以對臨床樣本進行快速、簡便、低廉的檢測。無線傳感技術具有成本低、便于批量化制備、操作簡便等優(yōu)點，在通信、半導體、機械等領域已經(jīng)得到廣泛應用，但在生物檢測方面的應用國內(nèi)鮮有報道[9～12]。

本文提出了一種新型的諧振式無源無線生物傳感器，根據(jù)不同濃度的CEA抗原改變叉指電極的電容值引起帶寬值發(fā)生變化，通過電感線圈互感耦合的方式讀取傳感器信號，實現(xiàn)快速檢測CEA抗原的濃度，從而為良性與惡性腫瘤的判斷提供簡便的檢查方式，實現(xiàn)即時檢驗的功能。

1 實 驗

1.1 試劑和耗材

CEA，癌胚抗原的特異性抗體(anti-CEA)，癌胚抗原量子點抗體(anti-CEA二抗)均購自上海領潮生物科技有限公司。(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane,APTES)、戊二醛(glutaraldehyde,GLU)和光敏苯并環(huán)丁烯(benzocyclobutene，BCB)購自Sigma公司。10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)(pH值為7.2±0.1)購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司。食人魚(piranha)溶液為濃硫酸(H2SO4)和30 %過氧化氫(H2O2)的混合物(體積比7︰3)。在實驗中，所購買的化學試劑和化學用品均可直接使用，無需純化。所有的溶液配制均采用18 MΩ的MilliQ凈化系統(tǒng)制備的超純水。

1.2 諧振式無線傳感器制備工藝

無線傳感器包含叉指電極和電感線圈2個部分，制作工藝流程為：

1)清洗石英片:將石英片浸沒在濃硫酸和雙氧水的混合溶液中(兩者比例約為10︰1)加熱清洗直到溶液中的氣泡消失，再依次放入到丙酮/乙醇/去離子水中分別進行超聲清洗，用干燥潔凈的氮氣吹干。

2)勻膠光刻:在石英片表面旋涂光刻膠，通過曝光與顯影在襯底表面光刻出金屬電極的圖形。

3)金屬蒸發(fā):通過電子束蒸發(fā)在襯底表面沉積10 nm厚的鈦膜和200 nm厚的金膜。

4)金屬剝離:將輪廓以外的金屬剝離，完成金屬電極和電感的初步制作。

5)再一次光刻，涂覆BCB，厚度為6 μm，顯影后280 ℃固化3 h。

6)為了橋接電感和電極，重復步驟(2)～步驟(5)，在兩者之間制作第二層金屬,得到無線傳感電極基底。

1.3 無線生物傳感器的修飾制備

無線生物傳感器的制備通過表面化學修飾的方法完成，具體修飾過程為：

1)清洗電極基底：為了去除電極表面存在的有機物，將電極依次浸泡在丙酮、無水乙醇、piranha溶液和氫氧化鈉溶液中，最后用去離子水沖洗干凈，在空氣中晾干。

2)硅烷化處理：在將生物分子固定于相鄰電極之間的間隙里之前，電極間隙需進行硅烷化處理。將潔凈干燥的電極進行等離子體(Plasma)處理；將電極基底浸入含4 % APTES的無水乙醇溶液中；用無水乙醇清洗，120 ℃加熱固定。

3)活化處理：將經(jīng)過硅烷化處理的電極基底在戊二醛的水溶液中活化1 h后，用去離子水沖洗干凈。

4)交聯(lián)抗體：在電極表面加入0.1 mg/mL鼠抗人Anti-CEA抗體溶液，于37 ℃孵育2 h，使抗體分子通過戊二醛的交聯(lián)作用固定在電極間隙;在牛血清蛋白(bull serum albumin,BSA)溶液中封閉1 h;固定好抗體的電極用去離子水清洗干凈后在4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5)孵育抗原:配制所需濃度的抗原溶液，加入到已經(jīng)固定好抗體的電極上，于37 ℃孵育2 h，用PBS沖洗未結合的抗原;氮氣吹干，準備電學測試。

1.4 腫瘤標志物的電學檢測

電極上制備的單層電容電感(LC)諧振電路與讀取器構成無線信號讀取單元。讀取設備由連接兩匝線圈天線的矢量網(wǎng)絡分析儀組成。傳感器系統(tǒng)電容電感值的變化轉換為諧振點頻率特性(即帶寬)的變化。頻率范圍設置為10 MHz～1 GHz，每次測試重復3次，取平均值。

2 結果與討論

2.1 無線生物傳感器的檢測原理

利用普通光學顯微鏡觀察叉指電極的結構，無源無線生物傳感器主要由單層電感線圈L和叉指電容器C串聯(lián)組成，外部讀出系統(tǒng)主要由矢量網(wǎng)絡分析儀和測試線圈組成，如圖1(a)所示。測量時，將生物傳感器靠近測試線圈，矢量網(wǎng)絡分析儀輸出交流信號施加在測試線圈上，通過與生物傳感器上的LC諧振回路的電感線圈L互感耦合完成傳遞能量和信號。電極表面結合的癌胚抗原改變了傳感器的參數(shù)，使傳感器的復阻抗發(fā)生變化，從而改變傳感器的帶寬值。因此，傳感器帶寬的變化可以用于表征與傳感器結合的癌胚抗原的濃度，實現(xiàn)癌胚抗原的無線無源檢測。

該無線傳感器的等效電路圖如圖1(b)所示。其中L2為傳感器線圈的電感量，R2為線圈的電阻值。C2為叉指電極的電容值，RC為叉指電極的介質(zhì)損耗電阻值。L1為測試線圈的電感量，R1為測試線圈的電阻值。生物傳感器的諧振頻率f的表達式為

(1)

圖1 無線生物傳感器的測量過程

傳感器諧振回路的帶寬(bandwidth,B)通過在不同的驅動頻率下測量復阻抗變化得到，而帶寬的變化能夠反映傳感器系統(tǒng)結合的癌胚抗原的濃度。觀察無線生物傳感器的阻抗譜，可知復阻抗最大值對應的頻率為傳感器的諧振頻率，通過計算-3 dB處的頻率范圍可以得到傳感器的帶寬為

(2)

2.2 修飾方法的表征結果

傳感器電極表面經(jīng)過硅烷化、活化處理之后，加入量子點Anti-CEA抗體(一抗)，觀察其是否能夠牢固連接到電極表面。在熒光顯微鏡下電極間隙出現(xiàn)分布均勻明亮的綠色熒光條帶，驗證了Anti-CEA抗體能夠均勻修飾到傳感器電極表面。另外，電極經(jīng)活化處理，并在孵育Anti-CEA一抗和CEA抗原之后，再加入量子點Anti-CEA(二抗)鑒定CEA抗原的特異性，觀察CEA抗原抗體特異性結合的情況。熒光顯微鏡下可以看到免疫反應區(qū)域出現(xiàn)均勻明顯的紅色熒光條帶，驗證了與Anti-CEA一抗結合的是CEA抗原，排除了非特異性結合的干擾。上述結果表明：在該傳感器電極表面不僅Anti-CEA抗體能夠連接到電極表面，且CEA抗原能夠和固定在電極上的Anti-CEA抗體特異性結合。證明電極上進行的抗原抗體特異性結合免疫反應有效可行。

2.3 腫瘤標志物的檢測效果

將空載電極連接到矢量網(wǎng)絡分析儀進行掃頻測試，得到空載狀態(tài)的帶寬值。在傳感器修飾制備過程中，加入戊二醛、Anti-CEA一抗、10 ng/mL CEA抗原溶液后分別進行掃頻測試，觀察傳感器系統(tǒng)諧振時帶寬的變化。如圖2所示，在電極上修飾不同物質(zhì)，所對應的帶寬值變化顯著。隨著電極表面修飾的生物化學物質(zhì)越多，帶寬值變化越大。也就是說，傳感器表面狀態(tài)的細微變化就能引起傳感器系統(tǒng)電容值的變化，使得諧振點的頻率特性也隨之改變。因此，該傳感器能夠靈敏地檢測出不同的修飾狀態(tài)，能夠檢測出傳感器系統(tǒng)細微的變化，具有良好的靈敏度。

圖2 實驗過程的帶寬值變化

配制濃度梯度為1,10,100,1 000 ng/mL的CEA抗原溶液，與固定在電極上的Anti-CEA抗體進行特異性結合反應后傳感器系統(tǒng)的響應如圖3所示。

圖3 帶寬值隨不同濃度CEA抗原的響應變化曲線

可見，隨著CEA抗原濃度的增加，帶寬值也不斷增大，且存在很強的相關性，線性擬合得到相應的回歸方程為帶寬值B=4.526 67×106×lg(CEA抗原濃度)+7 433 333.35，相關系數(shù)R2=0.994 59。該傳感器有較廣的適用濃度檢測范圍，初步檢測到CEA抗原濃度范圍為1～1 000 ng/mL，最低檢測濃度為1 ng/mL，具有良好的適用性。

3 結束語

本文提出了一種基于互感耦合無線檢測的叉指電極生物傳感器。通過微機電系統(tǒng)技術制備得到該傳感器的叉指電容和耦合線圈結構，利用戊二醛交聯(lián)共價修飾方法在傳感器電極表面連接上Anti-CEA抗體，通過抗原抗體特異性結合的免疫反應，實現(xiàn)了對CEA抗原的特異性和高靈敏檢測。該傳感器可以為腫瘤標志物的即時檢驗提供依據(jù)和可行性。

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