◎ 張建煬，楊 坤，唐國(guó)芳

（貴州省黔東南州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州 凱里 556000）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，人們對(duì)于保健品的需求不斷增長(zhǎng)，特別是保健酒的需求也不斷上升。為了使保健酒的功效顯著，一些不法商販人為地添加西藥成分以達(dá)到宣稱的具有純中藥成分的保健酒[1]。由于制造工藝、含量均勻性差和配料表里未標(biāo)注其添加成分含量，給消費(fèi)者的健康帶來巨大的安全危害[2-3]，如過量服用這些非法添加的保健酒，輕者會(huì)引起頭痛、消化不良、顏色分辨下降等不良反應(yīng)，對(duì)于心血管患者，嚴(yán)重者可能導(dǎo)致突然死亡[4-5]。

文獻(xiàn)報(bào)道的西地那非和他達(dá)拉非檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、薄層色譜法（TLC）及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）等[6-7]，測(cè)定保健酒的報(bào)道很少。目前，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)件[8]針對(duì)檢測(cè)西地那非和他達(dá)拉非的高效液相色譜法存在色譜峰型差，流動(dòng)相酸度大及液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)容易受樣品污染等問題，很難準(zhǔn)確達(dá)到分離定性問題。Waters Atlantis?T3色譜柱是基于超純硅膠基質(zhì)的反相C18色譜柱，用于保留和分離強(qiáng)極性化合物，并且在很寬的pH值范圍內(nèi)保持卓越性能，對(duì)于復(fù)雜的樣品有優(yōu)良的分離。針對(duì)普通C18柱很難分離西地那非和他達(dá)拉非，目標(biāo)峰型差、半峰很寬，并且洗脫溶劑需要用磷酸調(diào)pH值到2.8，低pH值容易損傷色譜柱，降低色譜柱分離能力等問題，本文以Waters Atlantis?T3作為色譜柱，用甲醇和10 mmol/L的乙酸銨作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，最大程度降低對(duì)色譜柱的損害，并對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，以達(dá)到定性的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西地那非（中國(guó)食品藥品檢定研究院，CAS號(hào)139755-83-2，純度99.9%），他達(dá)拉非（中國(guó)食品藥品檢定研究院，CAS號(hào)171596-29-5，純度99.9%），乙腈、甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher公司），乙酸銨（色譜純）。

Thermo Ulimate 3000高效液相色譜儀（配DAD檢測(cè)器，變色龍7.1色譜工作站，Thermo公司），AB API4000+超高效液相色譜/串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（配電噴霧離子源（ESI），美國(guó)AB SCIEX公司），Centrifuge5702離心機(jī)（德國(guó)eppendorf公司），Talboys旋渦混合器，Milli-Q純水儀（美國(guó)Millipore公司），MS205DU電子天平（美國(guó)梅特勒-托利多儀器公司）。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Atlantis?T3（Waters，4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；流動(dòng)相：溶劑A為甲醇，溶劑B為0.01 mol/L的乙酸銨（見表1）。

表1 梯度洗脫表

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制

精密稱取西地那非、他達(dá)拉非標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，置于50 mL的容量瓶中，用乙腈稀釋定容至刻度，搖勻即得，避光儲(chǔ)存于2～5 ℃的冰箱中。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品使用液的配制

精密吸取1.00 mL標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，定容至10.0 mL容量瓶，配制成含西地那非和他達(dá)拉非各20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品使用液。

1.2.2.3 工作曲線的配制

準(zhǔn)確吸取 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL和10.0 mL分別置于10 mL容量瓶，用乙腈配制成含2.0、4.0、8.0、12.0、16.0 μg/mL和20.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 樣品制備

準(zhǔn)確稱取試樣約10.0 g，于50 mL離心管中，加乙腈30 mL，以2 500 r/min漩渦混合10 min，加乙腈定容至刻度，以3 000 r/min離心5 min，再用0.45 μm微孔有機(jī)濾膜過濾于進(jìn)樣瓶中供HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

分別選用Thermo Hyperall C18、Dikma Diamonsil C18、Waters Symmetry Shield RP18 和 Waters Atlantis?T3 C18色譜柱分析西地那非和他達(dá)拉非。結(jié)果表明，Waters Atlantis?T3 C18色譜柱可以獲得良好的分離度和峰型，并且樣品中其他雜質(zhì)對(duì)主峰無干擾。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

為使分離效果達(dá)到最佳，分別選擇用甲醇+乙腈+磷酸三乙胺溶液、甲醇+水、甲醇+乙酸銨溶液作為流動(dòng)相，以不同比例溶劑梯度洗脫分離西地那非和他達(dá)拉非。結(jié)果表明，采用甲醇+乙腈+磷酸三乙胺溶液峰型很差，基線漂移大；采用甲醇+水作為流動(dòng)相峰型好，但分離度不是很好，而且基線不穩(wěn)；采用甲醇+0.01 mol/L乙酸銨作為流動(dòng)相峰型、分離度好，基線比較平穩(wěn)。幾種流動(dòng)相條件下分別進(jìn)20 μg/mL混合對(duì)照品，色譜圖按順序見圖1。

圖1 不同流動(dòng)相條件下西地那非和他達(dá)拉非色譜圖

2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

提取西地那非和他達(dá)拉非標(biāo)準(zhǔn)溶液在200～400 nm的紫外光譜掃描圖，發(fā)現(xiàn)其在波長(zhǎng)220～230 nm處有較大的吸收且基線平穩(wěn)，故采用230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。光譜圖見圖2。

圖2 西地那非和他達(dá)拉非光譜圖

2.2 結(jié)果

2.2.1 線性方程和檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液依次進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，用Orign7.5軟件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行線性回歸得西地那非和他達(dá)拉非標(biāo)準(zhǔn)系列（2.0～20μg/ml）的回歸方程分別為Y=0.504 65X+0.114 41，R=0.999 86和Y=0.429 44X+0，R=0.999 99，結(jié)果見圖3，西地那非和他達(dá)拉非在上述濃度內(nèi)線性關(guān)系良好。當(dāng)取樣量為10.0 g時(shí)，信噪比S/N≥3時(shí)，確定其檢出限LOD分別為0.82 mg/kg和0.94 mg/kg。

圖3 西地那非和他達(dá)拉非標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2.2 精密度和回收試驗(yàn)

用本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)8款保健酒樣品進(jìn)行測(cè)定，樣品中均未檢出西地那非，有一樣品中疑似檢出他達(dá)拉非。經(jīng)光譜圖對(duì)比后發(fā)現(xiàn)不是他達(dá)拉非，見圖4，同時(shí)用液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行確認(rèn)。在陰性樣品中分別添加西地那非和他達(dá)拉非標(biāo)準(zhǔn)品0.1～0.5 mg/kg，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

圖4 樣品中疑似他達(dá)拉非成分的光譜圖

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果表

由表2可知，西地那非的回收率為96.0%～102.0%，他達(dá)拉非的回收率為90.0%～96.6%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%，表明所建立的分析方法的精密度和準(zhǔn)確度均較高，滿足檢測(cè)要求。

2.2.3 LC-MS/MS確認(rèn)

（1）色譜條件。色譜柱：Waters Symmetry Shield RP（100mm×2.1mm，5μm）；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸的甲醇；B為0.1%甲酸的10 mmol/L乙酸銨；梯度洗脫程序見表3。

表3 梯度洗脫程序表

（2）質(zhì)譜參數(shù)。西地那非和他達(dá)拉非采用正離子檢測(cè)方式（ESI+），質(zhì)荷比范圍：m/z 50～500；毛細(xì)管電壓2.8 kV，錐孔電壓55 V，離子源溫度500 ℃，采用全掃描一級(jí)質(zhì)譜、選擇離子二級(jí)全掃描質(zhì)譜檢測(cè)方式。

（3）測(cè)定結(jié)果。將1.2.2.3項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液和2.2.2項(xiàng)下陽(yáng)性供試品溶液按上述條件進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，未檢測(cè)到樣品與西地那非和他達(dá)拉非標(biāo)準(zhǔn)品相同保留時(shí)間的一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜圖。

2.3 討論

本文選用Atlantis?T3 C18色譜柱在不同流動(dòng)相條件對(duì)保健酒中的西地那非和他達(dá)拉非進(jìn)行測(cè)定，在流動(dòng)相為甲醇+0.01 mol/L乙酸銨進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，保健酒中西地那非和他達(dá)拉非檢測(cè)靈敏度高，基線平穩(wěn)，選擇性較好，不用對(duì)流動(dòng)性進(jìn)行調(diào)pH值，有效延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命；同時(shí)利用DAD掃描圖對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品進(jìn)行對(duì)比，可以有效降低假陽(yáng)性率，適用于實(shí)際工作中保健酒里西地那非和他達(dá)拉非的檢測(cè)。

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[8]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢測(cè)項(xiàng)目批準(zhǔn)件編號(hào)2009030[Z].2009.