任德強(qiáng)，宋新剛，張立恒

（哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司，黑龍江 哈爾濱 150026）

ST細(xì)胞是豬睪丸細(xì)胞，主要用于豬細(xì)小病毒、豬瘟等疫苗的制備。為了降低長期傳代對細(xì)胞造成的損傷，需要對其進(jìn)行低溫冷凍保存。低溫冷凍保存是細(xì)胞長期保存的唯一方法，還可減少細(xì)胞被微生物污染的風(fēng)險，減少因傳代培養(yǎng)而引起的細(xì)胞遺傳變異和形態(tài)改變。因此要找到一個適合的凍存密度，使細(xì)胞在凍存和復(fù)蘇過程中活力下降最少。該試驗(yàn)中以4個不同的密度凍存ST細(xì)胞，復(fù)蘇后檢驗(yàn)活力，并分析凍存密度與活力之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 試 劑

培養(yǎng)液MEM(Gibco)；胎牛血清FBS(Gibco)；二甲基亞砜(Sigma)；Trypsin-EDTA(Gibco)。

1.2 細(xì)胞系

ST傳代細(xì)胞購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 主要儀器設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱 (HF240型)，HealForce公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀Countstar，上海睿鈺公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶，美國Corning公司；倒置顯微鏡（TS100），Nikon公司。

1.4 凍存液的配制

MEM的含量為60%，DMSO 10%，血清 30%。

1.5 細(xì)胞的消化

消化對數(shù)生長期的細(xì)胞，1000r/min離心 5min。

1.6 不同密度細(xì)胞液的配制

離心后棄上清液，加入適量凍存液，計(jì)數(shù)，配制4個不同密度的細(xì)胞液：0.5×107個/mL；1.0×107個/mL；2.0×107個/mL；3.0×107個/mL。

1.7 細(xì)胞分裝與凍存

將4個不同密度的細(xì)胞液進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算活力，然后分別裝入凍存管中，l.5mL/管。4℃放置2h，-80℃放置18h，放入液氮中的程序進(jìn)行凍存。

1.8 細(xì)胞復(fù)蘇

細(xì)胞凍存2周后進(jìn)行復(fù)蘇，每個密度復(fù)蘇3管。從液氮中取出凍存管直接放入37℃溫水中，并不時搖動使其在1 min內(nèi)盡快融化。融化后以1000r/min離心5min，棄上清液，每管加入1.5mL培養(yǎng)液，計(jì)數(shù)測活力。以上操作重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞凍存前的密度和活力 見表1。細(xì)胞活力都在90%以上，符合細(xì)胞凍存標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 復(fù)蘇后細(xì)胞的密度和活力。

3 討論

豬睪丸細(xì)胞（ST）在貼壁條件下，可以實(shí)現(xiàn)在體外的連續(xù)培養(yǎng)，該細(xì)胞系對豬瘟、細(xì)小病毒、傳染性胃腸炎等多種病毒敏感，是疫苗生產(chǎn)中的常用細(xì)胞，細(xì)胞系的保存條件對疫苗生產(chǎn)至關(guān)重要。

上海畜牧獸醫(yī)研究所的彭麗英等人從中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所引進(jìn)40代ST細(xì)胞，在傳代過程中對細(xì)胞的生長速度、外源病毒檢測、染色體數(shù)目等項(xiàng)目進(jìn)行檢測，并建立了ST細(xì)胞種子庫的凍存方法，為疫苗生產(chǎn)的開展奠定了工作基礎(chǔ)。在本研究中對ST細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞復(fù)蘇后的活力也都在90%以上，3次試驗(yàn)復(fù)蘇后的平均活力分別與細(xì)胞凍存前的活力相比較，3次試驗(yàn)凍存前的活力雖然與細(xì)胞密度沒關(guān)系，但無論細(xì)胞是以多大的密度凍存，復(fù)蘇后，細(xì)胞的活力都會有所下降，而且會隨著凍存密度的增高而降低。雖然降低的幅度不是很大，都在90%以上，但也說明凍存細(xì)胞的密度與復(fù)蘇后細(xì)胞的活力呈反比。因此凍存細(xì)胞的密度與復(fù)蘇后細(xì)胞的活力有相關(guān)性。

表2 細(xì)胞的密度和活力測定結(jié)果

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