王旭哲，張凡凡，馬春暉，苗 芳，唐開(kāi)婷，李菲菲

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003）

0 引 言

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，玉米青貯飼料的重要性日益突顯[1-2]。玉米青貯主要依靠乳酸菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)生乳酸降低pH值，并通過(guò)降低葉片呼吸和酶活性，抑制霉菌、梭狀芽孢桿菌、酵母菌和其他不利微生物生長(zhǎng)，從而使玉米青貯得以保存[3-4]，因此乳酸菌被認(rèn)為是青貯飼料發(fā)酵過(guò)程中最重要的因素之一[5]。其發(fā)酵產(chǎn)生高濃度的乳酸，但在開(kāi)窖后，不良微生物的大量消耗致使青貯飼料有氧穩(wěn)定性降低，即青貯過(guò)程中微生物群落的變化將影響最終青貯飼料的品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性[6-8]。主要由于酵母菌等微生物在好氧條件中利用這些化合物作為底物產(chǎn)生CO2、水和熱量，進(jìn)而導(dǎo)致pH值上升，致使不耐低pH值的絲狀真菌和芽孢菌等有害菌生長(zhǎng)增殖[9]。

為提高玉米青貯有氧穩(wěn)定性，很多學(xué)者提出使用乳酸菌添加劑[10-11]，認(rèn)為乳酸菌添加劑能有效地改善發(fā)酵青貯飼料的質(zhì)量，主要通過(guò)改變pH值，抑制有害的附生微生物生長(zhǎng)來(lái)提高有氧穩(wěn)定性[12-14]。Kharazian等[4]從伊朗玉米青貯飼料中分離得到的乳酸菌具有較高的抗真菌活性，可用作青貯飼料添加劑提高青貯玉米的質(zhì)量和有氧穩(wěn)定性。青貯飼料引入添加微生物菌劑這一概念是為了控制發(fā)酵，加入快速發(fā)酵的同型乳酸菌提高青貯飼料品質(zhì)[15]。根據(jù)Yuan等[5]研究可知，青貯飼料添加同型乳酸菌植物乳桿菌（Lactobacillus plantarumas）導(dǎo)致乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較對(duì)照有所提高。Liu等[16]的研究中同樣發(fā)現(xiàn)相對(duì)于未經(jīng)處理的青貯飼料，接種植物乳桿菌能提高青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)。此外，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）或片球菌屬（Pediococcus）的其他菌也經(jīng)常被使用[17]。但同型乳酸菌對(duì)于提高有氧穩(wěn)定性作用不顯著，近年來(lái)為提高有氧穩(wěn)定性并降低青貯發(fā)酵損失，異型發(fā)酵乳酸菌物種如布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）作為青貯添加劑添加到青貯飼料中[15,18]。布氏乳桿菌可產(chǎn)生抗菌的乙酸和細(xì)菌素等副產(chǎn)物，減少有氧惡化并改善青貯品質(zhì)[19]。微生物菌劑必須具備足夠數(shù)量以有效控制發(fā)酵，目前普遍認(rèn)為1×105cfu/g的乳酸菌添加量可以壓制青貯附生乳酸菌成為優(yōu)勢(shì)種群[20-21]。因此，應(yīng)用適當(dāng)?shù)娜樗峋臃N量可以確保青貯飼料質(zhì)量，防止青貯飼料變質(zhì)，提高經(jīng)濟(jì)效益[22]。此外，已經(jīng)提出同型發(fā)酵乳酸菌與布氏乳桿菌復(fù)合進(jìn)行添加，因?yàn)檫@ 2類(lèi)微生物的結(jié)合有可能提高發(fā)酵速度并提高有氧穩(wěn)定性[23-24]。然而，2種同型發(fā)酵乳酸菌共同添加或2種同型發(fā)酵乳酸菌與布氏乳桿菌復(fù)合添加提高玉米青貯有氧穩(wěn)定性及發(fā)酵特性的能力是未知的。

基于此，本研究設(shè)置添加不同發(fā)酵類(lèi)型的乳酸菌處理，探究同時(shí)添加 2種同型發(fā)酵乳酸菌、單一添加布氏乳桿菌以及 2種同型發(fā)酵乳酸菌與布氏乳桿菌復(fù)合添加對(duì)開(kāi)窖后玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)、微生物數(shù)量及有氧穩(wěn)定性的影響。旨在明確添加不同發(fā)酵類(lèi)型的乳酸菌處理在玉米青貯開(kāi)窖后，能否改善發(fā)酵品質(zhì)、降低有害微生物數(shù)量、提高有氧穩(wěn)定性，為生產(chǎn)實(shí)踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和樣地

試驗(yàn)選用新飼玉10號(hào)作為青貯原料。試驗(yàn)選定在石河子大學(xué)的牧草試驗(yàn)站（N 44°20′，E 88°30′，H 420 m）開(kāi)展。其生長(zhǎng)期：4月10日～8月20日（2015年），共計(jì)112 d，青貯玉米的刈割期定于乳熟末期/蠟熟初期進(jìn)行（玉米乳線超過(guò)2/3時(shí)），收割全株玉米，將青貯玉米切碎至1～2 cm。真空袋規(guī)格為50 cm×40 cm×0.24 mm。全株玉米青貯原料營(yíng)養(yǎng)成分和微生物數(shù)量見(jiàn)表1。

表1 玉米青貯原料營(yíng)養(yǎng)組成和微生物數(shù)量Table 1 Nutrients composition and microbial populations of corn silage of ensiling material

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)將添加乳酸菌設(shè)計(jì)為4個(gè)處理，CK處理（不加任何菌劑）；T處理（同型發(fā)酵乳酸菌）：Lactobacillus plantarum和Pediococcus acidilactici復(fù)合添加，添加量為1∶1，1×105cfu/g；Y 處理（異型發(fā)酵乳酸菌）：Lactobacillus buchneri，添加量為1×105cfu/g；TY處理（同型+異型發(fā)酵乳酸菌）：Lactobacillus plantarum、Pediococcus acidilactici和Lactobacillus buchneri復(fù)合添加，添加量為1∶1∶1，1×105cfu/g。并將各菌種在MRS（de man rogosa sharpe）液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，平板計(jì)數(shù)后確定其數(shù)量，按比例配置菌液。用滅菌噴壺均勻的噴灑至待貯青貯玉米表面（CK處理噴灑等量的去離子水）。噴灑完畢后立刻進(jìn)行青貯。采用真空袋法調(diào)制，每個(gè)處理4袋，每袋2.0 kg，室溫（25±3）℃下發(fā)酵60 d后（開(kāi)窖0 h）開(kāi)窖。檢測(cè)開(kāi)窖后第0、48、96、144、192，240 h青貯pH值、可溶性碳水化合物（water soluble carbohydrate,WSC）、乳酸（lactic acid，LA）、乙酸（acetic acid，AA）、氨態(tài)氮（NH3-N）、乳酸菌、霉菌、酵母菌以及好氧細(xì)菌數(shù)量的變化，對(duì) CO2產(chǎn)量進(jìn)行分析。開(kāi)窖全程動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)各處理青貯溫度變化。應(yīng)用隸屬函數(shù)法對(duì)青貯發(fā)酵品質(zhì)及微生物數(shù)量進(jìn)行綜合評(píng)判。

1.3 測(cè)定方法

DM 采用 105 ℃烘干法測(cè)定[25]；pH 值利用酸度計(jì)（PHS-3C，上海雷磁）測(cè)定；CP測(cè)定采用凱氏定氮法[10]；NDF和ADF采用范氏法（Van Soest）[25]；WSC測(cè)定采用蒽酮比色法測(cè)定[26]；有機(jī)酸（乳酸、乙酸、丙酸、丁酸）用液相色譜法測(cè)定[18]，氨態(tài)氮采用苯酚－次氯酸鈉比色法測(cè)定[27]；微生物數(shù)量采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，乳酸菌、霉菌、酵母菌以及好氧細(xì)菌分別用MRS培養(yǎng)基、高鹽察氏培養(yǎng)基、麥芽糖浸粉瓊脂培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。有氧穩(wěn)定性測(cè)定在發(fā)酵60 d后打開(kāi)全部實(shí)驗(yàn)室青貯發(fā)窖袋，袋口用雙層紗布包裹，防止果蠅等其他雜質(zhì)污染和水分散失，空氣可自由進(jìn)入發(fā)酵袋中，置于室溫條件下保存。將多點(diǎn)式溫度記錄儀（i500-E3TW，玉環(huán)智拓儀器科技有限公司）的多個(gè)探頭分別放置于發(fā)酵袋的幾何中心，同時(shí)在環(huán)境中放置3個(gè)探頭，用于測(cè)定環(huán)境溫度，溫度記錄儀測(cè)量時(shí)間間隔設(shè)置為5 min，每個(gè)處理放置 3個(gè)溫度探頭。如果樣品溫度高于環(huán)境溫度2 ℃，說(shuō)明青貯開(kāi)始腐敗變質(zhì)，此時(shí)記錄時(shí)間即為有氧穩(wěn)定時(shí)間。CO2的測(cè)定采用CO2產(chǎn)氣裝置進(jìn)行測(cè)定。CO2產(chǎn)氣裝置：按Ashbell等[28]的描述，自制評(píng)定有氧穩(wěn)定性的CO2產(chǎn)氣裝置。每套裝置包括2個(gè)500 mL 礦泉水塑料瓶，分上（放置25 g樣品）下（KOH溶液）2部分。取20 mL 20% KOH溶液，放入上述產(chǎn)氣裝置內(nèi)，置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行CO2產(chǎn)氣量測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

在Excel中作數(shù)據(jù)的基本處理，用SPSS 20.0對(duì)各處理的pH值、WSC、NH3-N、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量、CO2、乳酸菌、霉菌、酵母菌以及好氧細(xì)菌數(shù)量以及氧穩(wěn)定時(shí)間進(jìn)行方差分析，通過(guò)Duncan法對(duì)各處理間的差異進(jìn)行比較，并對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行具有互作效應(yīng)的雙因素方差分析。采用Origin 9.0進(jìn)行繪圖，對(duì)開(kāi)窖時(shí)間和各微生物數(shù)量進(jìn)行擬合分析。應(yīng)用 Fzuuy數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)法進(jìn)行青貯發(fā)酵品質(zhì)以及微生物數(shù)量的綜合評(píng)判。其中，與發(fā)酵品質(zhì)呈正相關(guān)的指標(biāo)（WSC、乳酸、乙酸、乳酸菌、有氧穩(wěn)定性）采用公式（1）計(jì)算，與發(fā)酵品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)的指標(biāo)（pH值、NH3-N、NH3-N/TN、霉菌、酵母菌、好氧細(xì)菌和CO2含量）采用公式（2）計(jì)算。

式中Fij為第i個(gè)處理第j個(gè)指標(biāo)的隸屬度；Xij為第i個(gè)處理第 j個(gè)指標(biāo)測(cè)定值；Xmax、Xmin為所有供試對(duì)象中第 j項(xiàng)指標(biāo)的最大值、最小值。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加不同乳酸菌有氧穩(wěn)定性變化及CO2產(chǎn)氣分析

玉米青貯中添加乳酸菌處理的有氧穩(wěn)定性如圖 1所示，各處理有氧暴露后穩(wěn)定的時(shí)間分別為CK：131.71 h，T：131.54 h，Y：195.58 h，TY：196.21 h。其中Y和TY處理有氧穩(wěn)定時(shí)間顯著高于其余處理 63.87～64.67 h（P＜0.05），且二者差異不顯著（P＞0.05）。同時(shí)CK和T處理間差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 不同處理玉米青貯的有氧穩(wěn)定性Fig. 1 Aerobic stability of different treatments corn silage

開(kāi)窖后，對(duì)各處理青貯樣品進(jìn)行CO2產(chǎn)氣分析（圖2），發(fā)現(xiàn)各處理的CO2產(chǎn)量和開(kāi)窖時(shí)間滿足Allometric1非線性關(guān)系（P＜0.01），其關(guān)系式為（3）。

試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著開(kāi)窖時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理的CO2產(chǎn)氣量逐步增加。對(duì)比各處理的產(chǎn)氣量發(fā)現(xiàn)，在開(kāi)窖全程 CK處理的 CO2產(chǎn)量始終顯著高于 T處理（1.8%～87.2%）、Y處理（33.7%～88.6%）和TY處理（9.9%～88.3%）（P＜0.05）。除開(kāi)窖240 h時(shí)添加乳酸菌的處理間差異不顯著（P＞0.05）外，其余開(kāi)窖過(guò)程中Y和 TY處理的CO2產(chǎn)量始終顯著低于T處理（P＜0.05），且Y處理顯著低于TY處理。即玉米青貯中乳酸菌的添加有助于降低在開(kāi)窖過(guò)程中玉米青貯中的 CO2濃度，同時(shí)異型發(fā)酵乳酸菌（布氏乳桿菌）的添加更易于減少CO2的產(chǎn)生。

圖2 開(kāi)窖后添加不同乳酸菌玉米青貯CO2產(chǎn)量變化Fig. 2 Change of CO2 production of corn silage adding different lactic acid bacteria after silos opened

2.2 添加不同乳酸菌處理開(kāi)窖后發(fā)酵品質(zhì)動(dòng)態(tài)變化

玉米青貯開(kāi)窖后，各處理pH值逐漸增加（表2），且在開(kāi)窖240 h時(shí)較開(kāi)窖0 h時(shí)上升了9.1%～15.1%。開(kāi)窖后CK處理pH值始終顯著高于其余處理3.5%～13.2%（P＜0.05），且在開(kāi)窖240 h后CK處理的pH值超過(guò)劣質(zhì)青貯的規(guī)定值4.80。而其余pH值均屬于青貯品質(zhì)一般的pH值范圍，T處理pH值始終顯著低于CK處理（6.0%～15.2%）、Y處理（2.4%～5.6%）和 TY處理（0.5%～3.9%）（P＜0.05）。Y 處理的 pH 值僅在開(kāi)窖96，144和192 h顯著高于TY處理（P＜0.05），在開(kāi)窖結(jié)束時(shí)二者差異不顯著（P＞0.05）。由上可知，添加乳酸菌處理在開(kāi)窖后pH值均較未添加處理低，即玉米青貯中乳酸菌的添加有助于抑制開(kāi)窖后青貯飼料pH值的升高。

各玉米青貯處理 WSC質(zhì)量分?jǐn)?shù)在開(kāi)窖后的變化見(jiàn)表2，開(kāi)窖240 h時(shí)各處理WSC質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較開(kāi)窖0 h時(shí)減少了31.4%～45.4%，即玉米青貯開(kāi)窖后各處理WSC質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸在減少，尤其CK 處理在開(kāi)窖0 h時(shí)WSC質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于其余處理11.1%～11.8%（P＜0.05），但開(kāi)窖0 h之后其WSC質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速降低，直至開(kāi)窖144 h時(shí)顯著低于其余處理（P＜0.05）。由表2可知，玉米青貯開(kāi)窖0 h之后，Y處理WSC質(zhì)量分?jǐn)?shù)始終顯著高于CK處理（10.3%～23.9%）、T處理（3.5%～16.2%）和TY處理（9.7%～24.5%）（P＜0.05），即單一添加異型發(fā)酵乳酸菌（布氏乳桿菌）可在開(kāi)窖后減緩玉米青貯中WSC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的減少。

開(kāi)窖后，各玉米青貯處理乳酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨開(kāi)窖時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，開(kāi)窖240 h時(shí)各玉米青貯乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理較開(kāi)窖0 h時(shí)降低了52.2%～69.5%。開(kāi)窖后T處理乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)始終顯著高于CK處理（2.4%～46.5%）和Y處理（8.3%～31.5%）（P＜0.05），同時(shí)除開(kāi)窖96 h外顯著高于 TY處理 3.8%～25.3%（P＜0.05）。除開(kāi)窖48和96 h外，其余開(kāi)窖時(shí)間CK處理的乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)始終顯著低于其余處理（P＜0.05）。而 Y處理在開(kāi)窖過(guò)程中乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)始終顯著低于 TY處理 5.0%～9.6%（P＜0.05）。由上可知，玉米青貯中乳酸菌的添加可以降低開(kāi)窖后乳酸的減少量，尤其是添加同型發(fā)酵乳酸菌效果較為明顯。

表2 開(kāi)窖后添加不同乳酸菌玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)變化Table 2 Change of fermentation characteristics of corn silage adding different lactic acid bacteria after silos opened

由表 2可知，玉米青貯開(kāi)窖后，各處理的乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均出現(xiàn)一定程度的上升趨勢(shì)（T和TY0～96 h，CK和Y0～144 h），之后逐漸下降，除T處理外，其余處理在240 h的乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較開(kāi)窖0 h減少22.9%～52.3%。其中開(kāi)窖后Y和TY處理乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)始終顯著高于CK和T處理（P＜0.05）。而在開(kāi)窖0～96 h，TY處理乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)始終顯著高于 Y處理（P＜0.05），此后直至開(kāi)窖結(jié)束時(shí)始終顯著低于 Y處理（P＜0.05）。由此可知，玉米青貯中添加含有異型發(fā)酵乳酸菌（布氏乳桿菌）的處理均對(duì)開(kāi)窖后抑制乙酸的損失具有積極作用。丙酸和丁酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，低于檢出線。

玉米青貯開(kāi)窖后，各處理NH3-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速增加，開(kāi)窖后240 h較開(kāi)窖0 h時(shí)增加了82.8%～251.5 %（表2）。其中CK處理的NH3-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加量最大，達(dá)251.5%，且開(kāi)窖0 h之后的有氧暴露過(guò)程中始終顯著高于T處理（11.1%～23.1%）、Y處理（14.9%～43.7%）和TY處理（15.0%～42.7%）（P＜0.05）。Y和TY處理 NH3-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)除開(kāi)窖0和48 h外，其余時(shí)間均顯著低于T處理（P＜0.05），但僅在開(kāi)窖0，96和240 h，Y處理NH3-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于TY處理（P＜0.05）。同時(shí)NH3-N/TN的變化與NH3-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化極為相似。因此，玉米青貯添加乳酸菌后在開(kāi)窖過(guò)程中可減少NH3-N的產(chǎn)生，且異型發(fā)酵乳酸菌（布氏乳桿菌）的添加更易于減少NH3-N的產(chǎn)生。

2.3 添加不同乳酸菌處理開(kāi)窖后微生物數(shù)量動(dòng)態(tài)變化

各玉米青貯處理中開(kāi)窖后 240 h乳酸菌數(shù)量顯著高于開(kāi)窖0 h時(shí)的10.7%～16.1%（P＜0.05，圖3a），其中添加乳酸菌處理的玉米青貯中 240 h乳酸菌數(shù)量極顯著高于開(kāi)窖0 h時(shí)（P＜0.01）。將各處理的乳酸菌數(shù)量與開(kāi)窖時(shí)間進(jìn)行擬合發(fā)現(xiàn)滿足ExpDec1非線性關(guān)系（P＜0.01），其關(guān)系式為式（4）。

試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著開(kāi)窖時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理的乳酸菌數(shù)量逐步增加。同時(shí)，T和TY處理乳酸菌數(shù)量除開(kāi)窖0和48 h外其余時(shí)間均顯著高于CK處理（P＜0.05），即玉米青貯中乳酸菌的添加有助于增加開(kāi)窖過(guò)程中玉米青貯中乳酸菌數(shù)量。

開(kāi)窖后，對(duì)各處理青貯樣品進(jìn)行霉菌數(shù)量分析（圖3b），將各處理的霉菌數(shù)量和開(kāi)窖時(shí)間進(jìn)行擬合發(fā)現(xiàn)滿足一元線性關(guān)系（P＜0.01），其關(guān)系式見(jiàn)式（5）。

隨著開(kāi)窖時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理的霉菌數(shù)量逐步增加。同時(shí)發(fā)現(xiàn)各處理開(kāi)窖后240 h霉菌數(shù)量著高于開(kāi)窖0 h時(shí)2.7%～21.7%（P＜0.05），其中添加乳酸菌處理的玉米青貯中240 h霉菌數(shù)量極顯著高于開(kāi)窖0 h時(shí)（P＜0.01）。Logistic開(kāi)窖后Y處理的霉菌數(shù)量始終顯著低于CK處理（4.6%～31.3%）、T處理（24.7%～34.4%）和 TY處理（31.0%～45.2%）（P＜0.05）。而 T和 TY處理的霉菌數(shù)量在開(kāi)窖后始終顯著高于其余處理（P＜0.05），即單一添加異型發(fā)酵乳酸菌（布氏乳桿菌）可在開(kāi)窖后抑制玉米青貯中霉菌的增長(zhǎng)，但添加同型發(fā)酵乳酸菌的效果不明顯，且復(fù)合添加 2種發(fā)酵類(lèi)型的乳酸菌反而使開(kāi)窖后霉菌數(shù)量增加。

玉米青貯開(kāi)窖后，各處理酵母菌數(shù)量變化如圖3c所示，開(kāi)窖后240 h酵母菌數(shù)量均極顯著高于開(kāi)窖0 h時(shí)117.7%～206.3%（P＜0.01），并從各處理的酵母菌數(shù)量與開(kāi)窖時(shí)間擬合分析中發(fā)現(xiàn)二者呈顯著的 Logistic非線性關(guān)系（P＜0.01），且關(guān)系式為式（6）。

圖3 開(kāi)窖后添加不同乳酸菌玉米青貯微生物數(shù)量變化Fig. 3 Change of microbial populations of corn silage at adding different lactic acid bacteria after silos opened

隨著開(kāi)窖時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理的酵母菌數(shù)量逐步增加。除48和192 h外，其余開(kāi)窖時(shí)間T處理酵母菌數(shù)量始終顯著低于TY處理1.7%～17.4%（P＜0.05）。而CK處理的酵母菌數(shù)量在 96～192 h顯著高于 T和 Y處理（P＜0.05）。即添加2種同型發(fā)酵乳酸菌或單一添加異型發(fā)酵乳酸菌（布氏乳桿菌）可在開(kāi)窖后大部分時(shí)間內(nèi)抑制玉米青貯中酵母菌的增長(zhǎng)，但復(fù)合添加 2種發(fā)酵類(lèi)型的乳酸菌反而效果不佳。

各處理玉米青貯開(kāi)窖 240 h好氧細(xì)菌數(shù)量均極顯著高于開(kāi)窖0 h時(shí)10.0%～22.2%（P＜0.01，圖3d），將各處理的好氧細(xì)菌數(shù)量和開(kāi)窖時(shí)間進(jìn)行擬合發(fā)現(xiàn)二者滿足一元線性關(guān)系，其關(guān)系式為式（7）。

隨著開(kāi)窖時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理的好氧細(xì)菌數(shù)量逐步增加。CK處理好氧細(xì)菌數(shù)量始終顯著高于 T處理（1.2%～15.1%）、Y處理（3.8%～15.1%）和 TY處理（3.1%～6.2%）（P＜0.05）。同時(shí)，Y 處理好氧細(xì)菌數(shù)量除開(kāi)窖96 h外均顯著低于TY處理（P＜0.05），并在開(kāi)窖第48、144和240 h顯著低于T處理（P＜0.05）。由此可知，玉米青貯中添加乳酸菌有助于降低開(kāi)窖過(guò)程的好氧細(xì)菌數(shù)量，同時(shí)異型發(fā)酵乳酸菌（布氏乳桿菌）的單一添加更易于減少好氧細(xì)菌的產(chǎn)生。

2.4 開(kāi)窖時(shí)間及添加不同乳酸菌處理對(duì)開(kāi)窖后玉米青貯品質(zhì)的交互作用

開(kāi)窖時(shí)間及試驗(yàn)設(shè)置的添加不同乳酸菌處理均對(duì)玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)和微生物數(shù)量產(chǎn)生極顯著影響（P＜0.01，表3），通過(guò)雙因素方差分析可知開(kāi)窖時(shí)間與處理的交互作用對(duì)上述所有指標(biāo)均產(chǎn)生極顯著影響（P＜0.01）。

2.5 添加不同乳酸菌處理開(kāi)窖后玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)及微生物數(shù)量的綜合評(píng)價(jià)

采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)值法，以pH值、WSC、乳酸、乙酸、NH3-N、NH3-N/TN、CO2產(chǎn)氣量、有氧穩(wěn)定性、乳酸菌、霉菌、酵母菌和好氧細(xì)菌數(shù)量12個(gè)指標(biāo)，對(duì)添加不同乳酸菌處理的玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)及微生物數(shù)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)（表4）。綜合評(píng)價(jià)分值越高則青貯品質(zhì)越好，反之越差。開(kāi)窖240 h后，對(duì)添加不同乳酸菌處理的玉米青貯發(fā)酵特性以及微生物數(shù)量的綜合排序?yàn)椋?/p>

Y處理＞TY處理＞T處理＞CK處理。

表4 開(kāi)窖后添加不同乳酸菌玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)及微生物數(shù)量隸屬函數(shù)分析Table 4 Analysis of membership function of fermentation characteristics and microbial quantity of corn silage adding different lactic acid bacteria after silos opened

3 討 論

3.1 添加不同乳酸菌對(duì)玉米青貯有氧穩(wěn)定性及 CO2產(chǎn)量的影響

青貯飼料在青貯容器開(kāi)封后的穩(wěn)定程度稱之為青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。在生產(chǎn)實(shí)踐中，有氧穩(wěn)定性代表青貯飼料對(duì)溫度升高的抵抗力，而對(duì)青貯溫度的監(jiān)測(cè)是開(kāi)窖后最常見(jiàn)的物料穩(wěn)定性的指標(biāo)[9]。本研究中各處理的CO2產(chǎn)量隨著開(kāi)窖時(shí)間逐漸增加，因?yàn)榍噘A開(kāi)窖后，厭氧環(huán)境立即轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒醐h(huán)境，其中好氧微生物的活動(dòng)性增強(qiáng)，其利用青貯發(fā)酵底物產(chǎn)生水、CO2和熱量[29]，直接導(dǎo)致青貯溫度上升。但添加乳酸菌有助于降低開(kāi)窖過(guò)程中玉米青貯中的 CO2濃度。因?yàn)榍噘A主要依靠乳酸菌進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，降低 pH從而抑制不良微生物生長(zhǎng)，減少營(yíng)養(yǎng)損失，進(jìn)一步減少 CO2的產(chǎn)生[21]。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)玉米青貯中添加乳酸菌可適當(dāng)提高有氧穩(wěn)定性，這與Jungbluth等[30]的研究結(jié)果一致，Jungbluth通過(guò)生物添加劑成功地抑制了青貯飼料的好樣腐敗，同時(shí)減少 CO2產(chǎn)量并提高有氧穩(wěn)定性。本研究中異型發(fā)酵乳酸菌（布氏乳桿菌）的添加更易于提高有氧穩(wěn)定性，減少CO2的產(chǎn)生，因?yàn)楫愋桶l(fā)酵的布氏乳桿菌可產(chǎn)生更多的乙酸，抑制好氧變質(zhì)，延長(zhǎng)有氧穩(wěn)定時(shí)間，而在有氧暴露期間，同型發(fā)酵乳酸菌所產(chǎn)生的乳酸可作為酵母菌生長(zhǎng)的底物，僅產(chǎn)生少量能抑制酵母菌和霉菌生長(zhǎng)的短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸）[29]。這一結(jié)果也從前人研究中得到了大量驗(yàn)證[15,31-32]，因此，單一接種同型發(fā)酵乳酸菌的玉米青貯有氧穩(wěn)定性較差。另一方面，從本研究結(jié)果中可知同型發(fā)酵乳酸菌和異型發(fā)酵乳酸菌的復(fù)合添加的處理有氧穩(wěn)定時(shí)間最長(zhǎng)，顯著高于對(duì)照組和單一接種同型發(fā)酵乳酸菌的玉米青貯處理（P＜0.05），但與單一接種異型發(fā)酵乳酸菌的玉米青貯有氧穩(wěn)定性無(wú)顯著差異（P＞0.05），這與Filya[33]報(bào)道較為相似。Filya用布氏乳桿菌和植物乳桿菌聯(lián)合接種高粱與玉米，與單獨(dú)使用布氏乳桿菌相比，得到折中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而聯(lián)合接種的青貯飼料比未接種的具有更好的有氧穩(wěn)定性。

3.2 添加不同乳酸菌對(duì)開(kāi)窖后玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

青貯飼料暴露在空氣中，pH值的增加是青貯飼料變質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)[9]。因?yàn)樵谇噘A開(kāi)窖后便進(jìn)入有氧發(fā)酵階段，此時(shí)大量以有機(jī)酸（乳酸、可溶性糖和乙醇）為主要營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)維持生存的微生物大量生長(zhǎng)。而乳酸在降低和維持低pH值青貯飼料中起著極為重要的作用[34]。當(dāng)大量以酵母菌為主的好氧微生物接觸到空氣時(shí)，消耗乳酸引起pH值的增加。因此，本研究中無(wú)論是否添加乳酸菌的處理pH均隨開(kāi)窖時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加。但是添加乳酸菌處理在開(kāi)窖后pH值均較未添加處理低。這與前人研究結(jié)果一致[30-31]，由于同型發(fā)酵乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生較多乳酸，開(kāi)窖后雖然有所損失，仍然較其余處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，可以維持較低pH環(huán)境[35]。同時(shí)，異型發(fā)酵乳酸菌在開(kāi)窖后可分解乳酸產(chǎn)生乙酸，在一定程度上維持了玉米青貯中低pH水平[36]。

本研究發(fā)現(xiàn)，各處理的WSC質(zhì)量分?jǐn)?shù)均逐漸減少。因?yàn)樵陂_(kāi)窖初期細(xì)胞呼吸作用，以及隨開(kāi)窖時(shí)間的增加青貯溫度的升高促進(jìn)酶的水解，可能引起部分WSC的分解，造成不消化成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相對(duì)增加，其中，WSC發(fā)酵轉(zhuǎn)化為 CO2[37]。但是單一添加異型發(fā)酵布氏乳桿菌可在開(kāi)窖后減緩玉米青貯中WSC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的減少。因?yàn)?，異型發(fā)酵布氏乳桿菌產(chǎn)生乙酸抑制好氧微生物增殖，降低WSC的消耗。而異型發(fā)酵乳酸菌除利用WSC產(chǎn)生乙酸外，還可以利用乳酸產(chǎn)生乙酸和少量的1,2-丙二醇[38]，即損失的WSC質(zhì)量分?jǐn)?shù)較少，乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)低，但高于對(duì)照組。本研究中添加同型發(fā)酵乳酸菌的玉米青貯處理開(kāi)窖后乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。因?yàn)樵陂_(kāi)窖初期氧氣質(zhì)量分?jǐn)?shù)較少，少量的氧氣刺激同型發(fā)酵乳酸菌利用青貯飼料中的WSC產(chǎn)生乳酸以維持低pH環(huán)境防止有氧腐敗，與Wang等[27]的研究結(jié)果相似。Romero的研究同樣表明添加布氏乳桿菌的青貯飼料在增加乙酸生產(chǎn)的同時(shí)，其乳酸濃度較未添加任何乳酸菌的對(duì)照組高[36]。Kleinschmit等[39]將全株玉米青貯接種布氏乳桿菌和片球菌，在51～361 d中比未接種組得到更高濃度的乙酸和1,2-丙二醇。從本研究中也發(fā)現(xiàn)同型發(fā)酵乳酸菌和異型發(fā)酵乳酸菌的復(fù)合添加的處理具有較高的乳酸和乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。其原因是該處理的WSC被大量消耗，主要被同型發(fā)酵乳酸菌用以產(chǎn)生乳酸，而其中一部分被異型發(fā)酵乳酸菌用以產(chǎn)生乙酸，同時(shí)異型發(fā)酵乳酸菌還利用乳酸產(chǎn)生乙酸。

NH3-N濃度主要反映蛋白質(zhì)的降解程度，是評(píng)價(jià)青貯飼料品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。玉米青貯開(kāi)窖后，pH值逐漸上升，當(dāng)pH值＞4.2時(shí)不良微生物的活動(dòng)，氨基酸被分解成氨、硫化氫和胺類(lèi)，降解率增大，使得NH3-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加[40]。本研究發(fā)現(xiàn)玉米青貯添加乳酸菌后在開(kāi)窖過(guò)程中可減少NH3-N的產(chǎn)生。Junior等[9]研究發(fā)現(xiàn)添加乳酸菌處理相比對(duì)照處理，能有效地降低青貯飼料中蛋白質(zhì)的降解。Wang等[27]的研究中也得到了相應(yīng)的證實(shí)，該研究通過(guò)設(shè)置玉米和苜?；旌锨噘A中添加植物乳桿菌，在開(kāi)窖后發(fā)現(xiàn)青貯飼料的發(fā)酵特性提高且保持低pH值，具有較高乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，同時(shí)降低氨態(tài)氮濃度。而本研究結(jié)果顯示異型發(fā)酵乳酸菌（布氏乳桿菌）的添加更易于減少NH3-N的產(chǎn)生，歸咎于異型發(fā)酵乳酸菌所產(chǎn)生的乙酸抑制好氧微生物的活動(dòng)，減緩對(duì)氨基酸的分解[11]。由于異型發(fā)酵的乳酸菌的作用，在復(fù)合添加乳酸菌的處理中NH3-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低。

3.3 添加不同乳酸菌對(duì)開(kāi)窖后玉米青貯微生物數(shù)量的影響

青貯飼料發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌數(shù)量占主導(dǎo)地位，使好氧微生物的活動(dòng)受到限制[15]。本研究發(fā)現(xiàn)玉米青貯中乳酸菌的添加有助于增加開(kāi)窖過(guò)程中玉米青貯中乳酸菌數(shù)量。因?yàn)殚_(kāi)窖后同型和異型發(fā)酵乳酸菌利用WSC等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維持生長(zhǎng)繁殖，由于添加的乳酸菌數(shù)量在青貯中占主導(dǎo)地位，因此即使開(kāi)窖后有氧環(huán)境不適于乳酸菌繼續(xù)生長(zhǎng)，但其數(shù)量仍然緩慢增加。Tran等[38]研究發(fā)現(xiàn)青貯飼料中固有的布氏乳桿菌暴露于空氣后，其活性不足以維持青貯飼料的安全穩(wěn)定。而布氏乳桿菌添加劑的使用可進(jìn)一步促進(jìn)乙酸產(chǎn)生，從而抑制好氧微生物的生長(zhǎng)，降低霉菌數(shù)量。本研究中單一添加異型發(fā)酵乳酸菌（布氏乳桿菌）可在開(kāi)窖后抑制玉米青貯中霉菌的增長(zhǎng)，但添加同型發(fā)酵乳酸菌的效果不明顯，且復(fù)合添加2種發(fā)酵類(lèi)型的乳酸菌反而使開(kāi)窖后霉菌數(shù)量增加。可能由于開(kāi)窖后玉米青貯中的厭氧環(huán)境被打破，且單一添加同型發(fā)酵乳酸菌及復(fù)合添加2種發(fā)酵類(lèi)型乳酸菌的玉米青貯中含有較高的乳酸，為霉菌的生長(zhǎng)繁殖創(chuàng)造了有利條件，雖然含有部分乙酸但其對(duì)霉菌的抑制作用弱于霉菌數(shù)量的增長(zhǎng)。

Jungbluth等[30]研究發(fā)現(xiàn)微生物開(kāi)始改變它們的新陳代謝，并利用氧作為對(duì)厭氧階段的直接反應(yīng)。一旦它們的新陳代謝從厭氧變成有氧，氧氣被微生物呼吸所消耗，伴隨著溫度上升。試驗(yàn)過(guò)程中各處理在開(kāi)窖后好氧細(xì)菌均有不同程度的增加，青貯pH環(huán)境的變化促使好氧微生物生長(zhǎng)，造成青貯營(yíng)養(yǎng)成分的進(jìn)一步的損失[41]。本研究中添加乳酸菌的玉米青貯中好氧細(xì)菌數(shù)量較對(duì)照組少，同時(shí)異型發(fā)酵乳酸菌的單一添加更易于減少好氧細(xì)菌的產(chǎn)生。這些抗菌性能是通過(guò)有機(jī)酸穿過(guò)細(xì)胞膜在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)解離并釋放H+的結(jié)果。其結(jié)果使細(xì)胞內(nèi)的pH迅速降低，產(chǎn)生大量ATP抵抗pH值下降以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，最終導(dǎo)致細(xì)胞減少或停止生長(zhǎng)[27]。在Kharazian等[4]對(duì)生物測(cè)定的結(jié)果中反映出，異型發(fā)酵乳酸菌相對(duì)于同型發(fā)酵菌具備較高抑菌性能。本研究發(fā)現(xiàn)單一添加同型或異型發(fā)酵乳酸菌可在開(kāi)窖后大部分時(shí)間內(nèi)抑制玉米青貯中酵母菌的增長(zhǎng)，但復(fù)合添加 2種發(fā)酵類(lèi)型的乳酸菌反而效果不佳。是由于開(kāi)窖后復(fù)合添加同型或異型發(fā)酵乳酸菌的玉米青貯中，其pH值高于添加同型發(fā)酵乳酸菌的玉米青貯處理，乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于單一添加異型發(fā)酵乳酸菌的玉米青貯中的玉米青貯處理。

Baek等[42]報(bào)道，明串珠菌和魏斯氏乳酸菌所產(chǎn)生的乳酸和乙酸的是主要抗菌物質(zhì)。已有的研究表明乳酸在抑菌中起重要作用，但不是唯一的一種。在 Kharazian等[4]的研究中，一些乳酸菌菌株沒(méi)有高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乳酸生產(chǎn)但顯示出較高的抑菌率，因此乳酸菌可能會(huì)產(chǎn)生一些其他的抗真菌物質(zhì)。異型發(fā)酵乳酸菌能抑制好氧變質(zhì)，其產(chǎn)生的乙酸被看作是主要的抑制物質(zhì)[18]。但Akihisa等[43]研究發(fā)現(xiàn)添加異型發(fā)酵乳酸菌 TM2的黑麥草青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)好，乙酸和丙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)也較少但有氧穩(wěn)定性比乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較多的乙酸添加青貯飼料好，說(shuō)明乳酸菌TM2能產(chǎn)生乙酸以外的抗酵母菌和霉菌的物質(zhì)。最近的研究已經(jīng)證實(shí)，一些乳酸菌生產(chǎn)其他抗真菌化合物，如環(huán)二肽、蛋白質(zhì)類(lèi)化合物、有機(jī)酸、脂肪酸和抑菌素[44-45]。因此，添加這類(lèi)不僅能提高青貯發(fā)酵品質(zhì)，而且能改善青貯飼料有氧穩(wěn)定性的乳酸菌值得研究與利用。

4 結(jié) 論

綜上所述，玉米青貯中添加不同乳酸菌對(duì)開(kāi)窖后青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)、微生物數(shù)量、有氧穩(wěn)定性影響顯著。綜合評(píng)價(jià)表明，單一添加異型發(fā)酵乳酸菌（Lactobacillus buchneri，添加量為 1×105cfu/g）的處理評(píng)分最高（0.790）。因此，單一添加異型發(fā)酵乳酸菌的玉米青貯，開(kāi)窖后在改善發(fā)酵品質(zhì)、降低有害微生物數(shù)量、提高有氧穩(wěn)定性方面均優(yōu)于單一添加同型或復(fù)合添加乳酸菌的玉米青貯。

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