宋 平，彭宇飛，王桂紅，宋 鵬，王開田，楊 濤※

（1. 沈陽農業(yè)大學信息與電氣工程學院，沈陽 110866；2. 北京農業(yè)信息技術研究中心，北京 100097；3. 國家農業(yè)智能裝備工程技術研究中心，北京 100097）

0 引 言

玉米是中國主要的糧食作物、飼料作物和經(jīng)濟作物，玉米種子的萌發(fā)情況在其繁衍和豐產(chǎn)方面具有重要的意義[1-4]。水分是玉米種子萌發(fā)不可或缺的必要條件，研究玉米種子萌發(fā)過程中種子內部水分的流動規(guī)律，觀察水分的動態(tài)運移過程，分析其內部生理代謝狀態(tài)，對于確定種子的發(fā)芽力具有重要的指導意義。傳統(tǒng)的研究方法一般是基于數(shù)量統(tǒng)計的發(fā)芽率研究，或者從時間角度考量水分變化情況，亦或通過對種子生理解剖來解釋其內部水分的分布情況。前者不能直接研究種子內部的水分分布及動態(tài)流動規(guī)律，后者作為一種破壞性的檢測方法無法持續(xù)監(jiān)測同一粒種子的水分變化過程，所以尋求一種快速、準確的檢測方式對玉米種子的萌發(fā)過程進行監(jiān)測具有重要的意義。

低場核磁共振技術以其非侵入及無損傷的優(yōu)勢，能夠直觀檢測對象的內部結構特征和水分分布情況，可以活體監(jiān)測作物的生理生化過程，近年在食品農業(yè)領域展開了廣泛的應用[5-13]。牟紅梅等[14]利用橫向弛豫時間反演譜并結合質子密度加權像，對小麥灌漿過程籽粒的水分變化規(guī)律進行了核磁共振活體檢測研究。王淼等[15]利用低場核磁共振技術對柑橘汁胞?；潭葘崿F(xiàn)了人工智能的鑒定和識別。楊文鴿等[16]利用低場核磁共振研究了鹽溶液的漂洗對帶魚魚糜凝膠水分分布和凝膠特性的影響。國際上農業(yè)領域專家也利用無損檢測技術對作物的萌發(fā)過程展開了諸多研究[17-27]，然而利用低場核磁共振技術對玉米種子萌發(fā)過程進行研究尚未見相關報道。

本試驗利用低場核磁共振技術對玉米種子的胚從靜止休眠狀態(tài)恢復至生理活躍狀態(tài)的萌發(fā)過程進行監(jiān)測。通過連續(xù)60 h對玉米種子的吸脹、萌動和發(fā)芽3個階段的萌發(fā)過程進行觀測，分析種子內部的水分含量變化典型時刻的水分分布狀況，測定不同萌發(fā)溫度對種子吸水及萌發(fā)情況的影響，對深入了解種子萌發(fā)過程的物質轉化，確定后期的生長發(fā)育及品質形成情況，及生產(chǎn)實踐具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗設備

MiniMR-60 核磁共振儀（磁體類型：永磁體，磁場強度：（0.5±0.05）T，射頻脈沖頻率：12.2 MHz，磁體溫度：32 ℃，探頭線圈直徑：15 mm，上海紐邁電子科技有限公司）；MGC-1500HP-2人工氣候箱（控溫范圍：有光照10～50 ℃，光照強度：0～40000 LX，光照方式：隔板式，上海一恒科學儀器有限公司）；Mettler-Toledo XS105 DualRange分析天平（最大稱量：120 g，梅特勒上海滬司實驗儀器有限公司）；另玻璃試管、刻度滴管、培養(yǎng)盒、發(fā)芽紙若干。

1.2 試驗材料

研究材料采用沈陽農業(yè)大學農學院的2016年玉米種子，本試驗力求對生產(chǎn)實踐提供幫助，故試驗玉米種子經(jīng)過包衣處理，品種分別為農大108號、遼單565號、郁青一號，各品種玉米種子的主要化學成分如表1所示。

表1 玉米種子的主要化學成分Table 1 Main chemical constituents of corn seeds

1.3 試驗方法

1.3.1 樣本制備

將 3個品種挑選外觀一致、大小均勻、成熟飽滿的玉米種子各160粒，每4粒為1組，每個品種制作40組平行的試驗樣本。為降低樣本間初始含水量差異對試驗結果的影響，對全部試驗樣本進行稱質量處理，試驗選取的每個樣本質量均為1.685 g，試驗樣本的初始質量含水率為13%左右。

1.3.2 核磁共振波譜試驗

首先利用標準油樣通過FID（free induction decay）脈沖試驗，尋找核磁共振的中心頻率及脈沖寬度，根據(jù)前期試驗結果及預試驗效果[28-30]，本試驗設置的參數(shù)值為：射頻信號頻率主值SF1=12 MHz，射頻90°脈沖脈寬P1=7.6 μs，射頻 180°脈沖脈寬 P2=11.8 μs。

將3個品種各40組試驗樣本的玉米種子分別垂直裝入玻璃試管的底端，并將玻璃試管水平插入至低場核磁共振儀中心位置，利用 CPMG（carr-purcell-meiboomgillsequence）脈沖序列進行核磁共振信號采集，獲取萌發(fā)時間為0 h的試驗數(shù)據(jù)，每組試驗樣本4次重復。CPMG脈沖序列的主要參數(shù)設置如下：采樣點數(shù) TD=161424，累加采樣次數(shù)NS=64，射頻信號頻率偏移量O1每次設置略有不同。

1.3.3 玉米種子萌發(fā)試驗

首先用質量分數(shù)為 3%的次氯酸鈉擦拭所有玉米種子的表面，對試驗樣本進行消毒處理，再利用蒸餾水沖洗 3次。然后將試驗樣本均勻放置在墊有單層濾紙的培養(yǎng)盒中，每個培養(yǎng)盒放 1組玉米種子。用刻度滴管將等量的蒸餾水直接滴在種子表面，以便種子充分吸水，加水完畢后在種子上面再覆蓋一層濾紙，并將發(fā)芽盒做密閉處理，以防水分散失。將3個品種的各20組試驗樣放在溫度為 25 ℃恒溫環(huán)境的人工氣候箱中，剩余的各 20組試驗樣放在溫度為31 ℃恒溫環(huán)境的人工氣候箱中，同時進行萌發(fā)培養(yǎng)，均保證發(fā)芽盒內水分充足，并設定氣候箱光照充足。

分別于12 h（吸脹階段的典型時刻）、36 h（萌動階段的典型時刻）、60 h（發(fā)芽階段的典型時刻）取出玉米種子[1]，用濾紙擦干種子表面水分，再利用低場核磁共振對試驗樣本進行跟蹤測量，采集此時刻試驗樣本的核磁共振信號數(shù)據(jù)，將采集過的試驗樣本補充水分后重新置于人工氣候箱繼續(xù)培養(yǎng)，實現(xiàn)對玉米種子萌發(fā)過程的監(jiān)測。

1.3.4 核磁共振波譜反演試驗

將核磁共振波譜分析軟件采集到的 4次重復數(shù)據(jù)導入SPSS軟件中計算獲取每個樣本的核磁共振數(shù)據(jù)均值，將均值作為試驗樣本的核磁信號幅值導入核磁共振反演軟件，對試驗數(shù)據(jù)進行反演運算。

根據(jù)前期試驗結果及預試驗效果[28-30]，反演軟件主要參數(shù)設定如下：分組形式為多分組，反演參數(shù)為 T2，開始時間為0.01 ms，截止時間為10 000 ms，參與反演點數(shù)為200個，迭代次數(shù)為100 000（根據(jù)試驗樣本特點及反演波譜效果設定）。

1.3.5 萌發(fā)率測定

將萌發(fā)試驗樣本分別于12、36、60 h從人工氣候箱中取出，對試驗樣本萌發(fā)種子數(shù)計數(shù)（以胚部膨脹破皮為準），計算種子萌發(fā)率。

種子萌發(fā)率=已萌發(fā)種子數(shù)/種子總數(shù)×100%，本試驗過程中3個品種玉米種子總的萌發(fā)率情況，如表2所示。

表2 3個品種玉米種子的總體萌發(fā)率Table 2 Overall germinating rate of 3 varieties corn seeds

1.4 數(shù)據(jù)處理

將核磁共振反演軟件導出的所有數(shù)據(jù)交由 SPSS軟件進行分析處理，所有數(shù)據(jù)均以均值±標準差形式表示。

2 結果與分析

2.1 玉米種子萌發(fā)過程內部水分相態(tài)的劃分

圖1為隨機選擇3個品種萌發(fā)時間為0 h的任意2個試驗樣本的核磁共振反演譜信號數(shù)據(jù)，橫坐標為橫向弛豫時間，縱坐標為核磁共振信號幅值。

圖1 玉米種子橫向弛豫時間反演譜Fig.1 Inversion spectrum of transverse relaxation time of corn seeds

根據(jù)低場核磁共振原理得知，通過T2反演譜呈現(xiàn)的多組分特征可以較為準確地區(qū)分樣品內部水分相態(tài)，根據(jù)水分含量與核磁共振T2反演譜信號幅值成正比可以計算被檢測物質的水分含量[28-30]。通過對玉米種子萌發(fā)過程連續(xù)60 h水分分布狀況的動態(tài)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，無論處于萌發(fā)的任何時期，每組試驗樣本的T2反演譜均有3個波峰，觀察發(fā)現(xiàn)，每個反演譜的橫向弛豫時間T2在10與100 ms處具有明顯的分界限。

根據(jù)低場核磁共振原理得知，橫向弛豫時間的長短可以反應樣品內部水分自由度的大小。橫向弛豫時間越短說明樣品內部水分自由度越低，橫向弛豫時間越長說明樣品內部水分自由度越高[28-30]。這里，將較短橫向弛豫時間T21（0.1～10 ms）部分的水分子定義為結合水，此種水分子與生物大分子結合緊密，動力學活性較小，其信號幅值用A21表示；較長橫向弛豫時間T22（10～100 ms）部分的水分子定義為半結合水，此種水分子流動性受一定的制約，其信號幅值用A22表示；最長橫向弛豫時間T23（100～1 000 ms）部分的水分子定義為自由水，此種水分子流動性較強，其信號幅值用A23表示；用A表示玉米種子的總水分含量，則A= A21+ A22+ A23。

表3為農大108號玉米種子在25 ℃萌發(fā)環(huán)境中，萌發(fā)時間為0、12、36和60 h的試驗數(shù)據(jù)，通過反演軟件得到的峰起始時間、峰頂點時間、峰結束時間以及峰面積統(tǒng)計數(shù)據(jù)，其他品種統(tǒng)計數(shù)據(jù)規(guī)律相近，這里不再贅述。

2.2 玉米種子萌發(fā)過程中各相態(tài)水分的流動規(guī)律

2.2.1 玉米種子萌發(fā)過程中內部結合水的流動規(guī)律

圖2為玉米種子萌發(fā)過程中內部結合水的流動規(guī)律，橫坐標軸為萌發(fā)時間，縱坐標軸為結合水的信號幅值。

表3 水分相態(tài)劃分橫向弛豫時間及信號幅值Table 3 Horizontal relaxation time and signal amplitude for moisture phase division

圖2 玉米種子萌發(fā)過程中內部結合水的流動規(guī)律Fig.2 Flow law of internal combined water during germination of corn seeds

觀察圖2發(fā)現(xiàn)，3個品種玉米種子試驗樣本在2個萌發(fā)環(huán)境中結合水含量均表現(xiàn)為先迅速增加后逐漸減小的趨勢，增加速度也呈現(xiàn)逐漸減弱現(xiàn)象。成熟的種子在貯藏階段，各組織比較堅實緊密，細胞內的物質呈干燥的凝膠狀態(tài)，當種子與水分直接接觸，種子將快速吸水膨脹。種子的化學組成主要是親水膠體，這些親水膠體快速與外界水分結合，所以萌發(fā)初期結合水含量將逐漸增加。當種子吸水達到一定程度，種子活性增強進入到萌動階段，這個時期種子內部的代謝開始增強，進入到一個新的生理狀態(tài)，隨著種子活性的增強，種子結合水將向半結合水形式轉化，水分與大細胞結合能力降低，結合水含量便呈現(xiàn)逐漸降低態(tài)勢。

2.2.2 玉米種子萌發(fā)過程中內部半結合水的流動規(guī)律

圖 3為玉米種子萌發(fā)過程中內部半結合水的流動規(guī)律。觀察圖3發(fā)現(xiàn)，3個品種玉米種子試驗樣本在2個萌發(fā)環(huán)境中半結合水含量均表現(xiàn)為持續(xù)增加態(tài)勢。種子萌發(fā)過程的吸水規(guī)律表現(xiàn)為“快-慢-快”的S型，但這種吸水規(guī)律在半結合水含量的變化上并沒有體現(xiàn)，因為處于萌動階段的玉米種子雖然整體的吸水量變化微弱，但種子內部的生理活動依舊旺盛，種子內部結合水、自由水同時向半結合水形式轉換，此時種子將分解調動足夠的營養(yǎng)物質供種子生長。

圖3 玉米種子萌發(fā)過程中內部半結合水的流動規(guī)律Fig.3 Flow law of internal semi combined water during germination of corn seeds

2.2.3 玉米種子萌發(fā)過程中內部自由水的流動規(guī)律

圖4為玉米種子萌發(fā)過程中內部自由水的流動規(guī)律。觀察圖4發(fā)現(xiàn)，3個品種玉米種子試驗樣本在2個萌發(fā)環(huán)境中自由水含量均表現(xiàn)為先減小后急劇增加的趨勢，增加速度也呈現(xiàn)逐漸增強現(xiàn)象。自由水是細胞間自由流動的水，負責把營養(yǎng)物質運送到各個細胞，其含量制約著細胞的代謝強度，自由水含量越大生物的代謝越旺盛。試驗樣本在室溫環(huán)境放置一段時間，種子的相對濕度平衡水分將因周圍環(huán)境的相對濕度較大而增加（試驗在 8月進行），此時這部分水以游離的形式存在于種子內部并沒有參與種子的化學反應，但在總水含量占比很低。萌發(fā)初期，自由水參與生物的化學反應，自由水向半結合水形態(tài)轉變，其含量呈微弱降低態(tài)勢，隨著萌發(fā)時間的推移，代謝旺盛的細胞需要大量的自由水參與生物的化學反應，所以自由水含量呈增加態(tài)勢，而且隨著細胞代謝的增強水分的增加趨勢也逐漸增強。

2.2.4 玉米種子萌發(fā)過程中總體水分的流動規(guī)律

圖 5為玉米種子萌發(fā)過程中總體水分的流動規(guī)律。觀察圖5發(fā)現(xiàn)，3個品種玉米種子試驗樣本在2個萌發(fā)化境中，核磁信號總體幅值呈逐漸遞增態(tài)勢，說明試驗樣本總體水分含量不斷增加，但增加速率有所不同。通過傳統(tǒng)檢測方法得知玉米種子萌發(fā)期的吸水率變化存在 3個階段，第一階段為快速吸水期，吸水速度迅速增加，第二階段為平穩(wěn)吸水期，吸水速度逐漸增大，第三階段為震蕩吸水期，本試驗利用低場核磁共振檢測與傳統(tǒng)試驗（烘干稱質量方式）結論基本一致，說明低場核磁共振是一種準確的水分檢測方式。

圖4 玉米種子萌發(fā)過程中內部自由水的流動規(guī)律Fig.4 Flow law of free water during germination of corn seeds

圖5 玉米種子萌發(fā)過程中總體水分的流動規(guī)律Fig.5 Flow law of total water during germination of corn seeds

2.2.5 玉米種子萌發(fā)過程中各相態(tài)水分流動情況總體分析

圖6為3個品種玉米種子在2種萌發(fā)環(huán)境中3種水分相態(tài)流動的整體情況。

圖6中核磁共振信號幅值0為圓心起點，在4個萌發(fā)時間以放射線的形式反映出相應的各相態(tài)形式水分含量增長情況。分析圖6發(fā)現(xiàn)，3個品種在2種萌發(fā)環(huán)境中，從0～60 h的萌發(fā)時間中3種水分相態(tài)的水分含量均有不同程度的增長，但增長速度不盡相同，這里結合水增長的速度均表現(xiàn)為最高，自由水增長的速度均反映為最低。

在種子萌發(fā)的初期，細胞吸水后開始了修復及活化的過程，90%的淀粉水解為葡萄糖，可溶蛋白質直接完全氨基酸化，非可溶性蛋白質部分被水解形成水溶性的較小分子量的蛋白質；脂肪被水解成甘油或氨基酸，在這一階段，水分子大量參與細胞活化反應，與種子中親水膠體結合，種子生理活動尚未到達旺盛狀態(tài)，但種子的生理狀態(tài)已經(jīng)較休眠期有了較大的變化。

2.3 萌發(fā)溫度對玉米種子各相態(tài)水分含量的影響

圖7為3個品種玉米種子在25℃與31℃的萌發(fā)環(huán)境的核磁共振信號幅值幅值差異。

圖6 玉米種子內部各相態(tài)水分的總體變化情況Fig.6 Overall situation of internal phase state water in corn seeds

圖7 萌發(fā)溫度對玉米種子內部各相態(tài)水分及總體水分分布的影響Fig.7 Effects of germination temperature on the distribution of internal phase state water and total water in corn seeds

通過觀察圖7a～7j發(fā)現(xiàn)結合水與自由水的變化隨萌發(fā)溫度的改變呈現(xiàn)反復變化的態(tài)勢，而提高萌發(fā)溫度玉米種子內部半結合水含量在各個典型時刻均呈現(xiàn)增強態(tài)勢。提高萌發(fā)溫度，玉米種子萌發(fā)活性增強，水分與生物體內細胞結合能力增強，大量儲藏的物質水解后被種胚吸收，種子細胞將吸收大量水分維持自身旺盛的代謝活動。

植物種子的萌發(fā)，除了受自身內部的生理條件影響外，還受外部環(huán)境的影響，種子發(fā)芽吸收的是液態(tài)水，當外界溫度提高，水分吸收加快。本試驗中提高人工氣候箱的溫度，種子內部酶活性及呼吸作用增強。萌發(fā)溫度的提高，加劇了細胞的新陳代謝速度，作物的生理活動更加旺盛，果糖、葡萄糖等有機碳水化合物的在酶的催化作用下表現(xiàn)為更強的生命活動狀態(tài)，種子水分的吸收速率也將隨之增強。觀察圖6發(fā)現(xiàn)3個品種的玉米種子的核磁共振信號總幅值均呈增加趨勢，與傳統(tǒng)方式驗證的結果具有一致性。

3 結 論

1）根據(jù)橫向弛豫譜的多組分特性，通過橫向弛豫時間的差異，將玉米種子內部水分劃分為 3種水分相態(tài)，將橫向弛豫時間T21（0.1～10 ms）定義為結合水，此種水分子與生物大分子結合緊密，動力學活性較小，其信號幅值用A21表示；橫向弛豫時間T22（10～100 ms）定義為半結合水，此種水分子流動性受一定的制約，其信號幅值用A22表示；橫向弛豫時間T23（100～1 000 ms）定義為自由水，此種水分子流動性較強，其信號幅值用A23表示。

2）3個品種玉米種子試驗樣本在2個萌發(fā)環(huán)境中，結合水含量均表現(xiàn)為先迅速增加后逐漸減小的趨勢，增加速度也呈現(xiàn)逐漸減弱現(xiàn)象；自由水含量均表現(xiàn)為先減小后持續(xù)增加的趨勢，增加速度也呈現(xiàn)逐漸增強現(xiàn)象；而半結合水和總體水分含量則不斷增加，3個品種玉米種子試驗樣本在萌發(fā)期間水分流動規(guī)律表現(xiàn)一致。吸脹階段的快速吸水、萌動階段的平穩(wěn)吸水、發(fā)芽階段的震蕩吸水的玉米種子萌發(fā)過程的低場核磁共振檢測與傳統(tǒng)烘干減重方式結論一致。

3）各相態(tài)水分與萌發(fā)溫度的變化不具有一致性，但當外界溫度提高，種子內部的半結合水和總體水分在萌發(fā)過程的各個典型時刻均表現(xiàn)為逐漸增強，說明提高萌發(fā)溫度，可以促進種子細胞與水分的結合程度，提高總體吸水速度，并提高玉米種子的萌發(fā)率。

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