李式昭,鄭建敏,伍 玲,李 俊,萬洪深,楊漫宇,羅江陶，劉廷輝,楊開俊,蒲宗君*

(1. 四川省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所/農(nóng)業(yè)部西南地區(qū)小麥生物學與遺傳育種重點實驗室, 四川 成都 610066; 2. 四川省甘孜州農(nóng)科所, 四川 康定 626000)

【研究意義】籽粒硬度是決定小麥品質(zhì)的關(guān)鍵性狀之一，對面粉顆粒大小、出粉率、潤麥加水量、破損淀粉含量和最終食品加工品質(zhì)都有重要影響。而穗發(fā)芽(Pre-harvest sprouting，PHS)則指小麥收獲前遇到陰雨天氣時籽粒在穗上發(fā)芽的現(xiàn)象，不僅降低產(chǎn)量，而且嚴重劣化品質(zhì)。穗發(fā)芽后的小麥α-淀粉酶活性提高，導致淀粉水解，面粉的降落值降低，烘烤品質(zhì)變差[1]。分析四川小麥籽粒硬度和穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因分布，對四川小麥的品質(zhì)改良具有重要意義。【前人研究進展】小麥籽粒硬度主要受位于5D染色體短臂上的1對主效基因Ha調(diào)控，由puroindoline蛋白控制，該蛋白的2種組分puroindoline a(PINA)和puroindoline b(PINB)是形成籽粒硬度的基礎(chǔ)，分別由基因Pina和Pinb編碼[2-3]。小麥籽粒硬度的差異主要源于Pina和Pinb基因的不同變異類型，當Pina和Pinb基因都處于野生(功能)狀態(tài)時，籽粒表現(xiàn)為軟質(zhì)；但當其中任一基因缺失或發(fā)生突變時，籽粒表現(xiàn)為硬質(zhì)，但也有例外[4]。軟質(zhì)麥適宜制作餅干和糕點等甜食，而硬質(zhì)麥則更適合制作面包和面條等食品。不同puroindoline等位變異類型對磨粉和加工品質(zhì)的影響也不盡相同，目前已命名17個Pina位點和25個Pinb位點的等位變異[5]。相較于Pina位點，對Pinb-D1b基因的研究則更為深入，該基因的氨基酸序列中第46位點的甘氨酸(Glycine，Gly)突變?yōu)榻z氨酸(Serine，Ser)，造成小麥質(zhì)地變硬。相關(guān)研究[6-8]表明，Pinb-D1b較Pina-D1b出粉率高、灰份低，磨粉品質(zhì)更好，此外，前者的饅頭、面包和面條加工品質(zhì)也略優(yōu)于PINA蛋白缺失和野生類型。小麥穗發(fā)芽則與種子的休眠期長短顯著相關(guān)，休眠期越長，穗發(fā)芽抗性越強；休眠期短或無休眠期的品種更易發(fā)生穗發(fā)芽[9]。Vp-1基因是種子成熟、干燥及休眠的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能促進胚成熟，加速休眠并抑制其萌發(fā)[10]，該基因位于小麥第3同源群染色體的長臂上[11]。研究[12-14]表明，等位基因類型Vp-1Bb和Vp-1Bc與抗穗發(fā)芽相關(guān)，而Vp-1Ba則與感穗發(fā)芽相關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c】目前，針對上述品質(zhì)性狀，國內(nèi)、外已開發(fā)出多種鑒定上述基因內(nèi)部等位變異的功能標記[15-16]，方便進行快速檢測?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用2個籽粒硬度相關(guān)分子標記Pinb-D1a、Pinb-D1b和1個穗發(fā)芽抗性等位基因分子標記Vp1B3，對2000年以來四川育成的105份小麥品種進行鑒定，旨在深入了解四川小麥品種籽粒硬度和穗發(fā)芽抗性相關(guān)等位基因的變異類型和分布規(guī)律，為選配有價值的品質(zhì)育種親本，加速四川小麥品質(zhì)育種進程提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗選用自2000年以來四川育成的105份優(yōu)良小麥新品種，其中包括：川麥系列32份、綿麥系列(含綿陽、綿麥、國豪麥)19份、川農(nóng)系列(含川農(nóng)、良麥、蜀麥)18份、川育系列(含川育、科成麥)10份、西科麥系列(含綿農(nóng)、西科麥)8份和其他單位品種18份。2個籽粒硬度和1個穗發(fā)芽抗性等位基因分子標記的引物序列信息見表1。

1.2 基因組DNA提取

每份品種采用5株幼苗混合取樣，參照Murray等[17]的微量CTAB法提取小麥基因組DNA，用于基因位點檢測，并確定105份品種的基因型。

1.3 PCR擴增及電泳檢測

全部3對引物均由生工(上海)生物工程股份有限公司(http://www.sangon.com)合成。PCR反應在AB Veriti型PCR擴增儀中進行，各分子標記的PCR反應體系、程序及擴增產(chǎn)物的檢測均采用表1參考文獻方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽粒硬度相關(guān)基因的分子標記檢測

在Pinb-D1位點，105份四川小麥品種中，有95份品種擴增出標記Pinb-D1a顯示非Pinb-D1b等位基因類型的250 bp特征帶(圖1A)，頻率為89.5 %；11份品種擴增出標記Pinb-D1b顯示Pinb-D1b等位基因類型(Pinb突變)的250 bp特征帶(圖1B)，頻率為10.5 %。

2.2 穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因的分子標記檢測

在Vp-1B位點，105份四川小麥品種中，有88份品種擴增出共顯性標記Vp1B3顯示Vp-1Bc(抗穗發(fā)芽)的569 bp特征帶，頻率為83.8 %；17份品種擴增出顯示Vp-1Ba(感穗發(fā)芽)的652 bp特征帶，頻率為16.2 %(圖2)；未能擴增出含有Vp-1Bb(抗穗發(fā)芽)等位基因類型的品種。

表1 分子標記PCR引物及其相關(guān)信息

M：DL2000；1：川麥39；2：川麥44；3：川麥50；4：川麥56；5：川麥65；6：川麥107；7：川農(nóng)23；8：綿陽35；9：綿麥46；10：川育20；11：西科麥4號；12：杏麥2號M: DL2000; 1: Chuanmai 39; 2: Chuanmai 44; 3: Chuanmai 50; 4: Chuanmai 56; 5: Chuanmai 65; 6: Chuanmai 107; 7: Chuannong 23; 8: Mianyang 35; 9: Mianmai 46; 10: Chuanyu 20; 11: Xikemai 4; 12: Xingmai 2圖1 特異性籽粒硬度標記Pinb-D1a(A)、Pinb-D1b(B)對部分供試品種的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR products amplified by specific grain hardness markers Pinb-D1a (A) and Pinb-D1b (B) in several tested cultivars

M：Trans2K plus DNA marker；1：川麥32；2：川麥37；3：川麥39；4：川麥42；5：川麥44；6：川麥48；7：川麥51；8：川麥55；9：川麥58；10：川麥62；11：川麥64；12：川麥104；13：川麥65；14：川麥107；15：川農(nóng)23；16：川農(nóng)27；17：綿陽30；18：綿麥37；19：綿麥51；20：川育20；21：西科麥4號；22：蜀麥482M: Trans2K plus DNA marker; 1: Chuanmai 32; 2: Chuanmai 37; 3: Chuanmai 39; 4: Chuanmai 42; 5: Chuanmai 44; 6: Chuanmai 48; 7: Chuanmai 51; 8: Chuanmai 55; 9: Chuanmai 58; 10: Chuanmai 62; 11: Chuanmai 64; 12: Chuanmai 104; 13: Chuanmai 65; 14: Chuanmai 107; 15: Chuannong 23; 16: Chuannong 27; 17: Mianyang 30; 18: Mianmai 37; 19: Mianmai 51; 20: Chuanyu 20; 21: Xikemai 4; 22: Shumai 482 圖2 特異性穗發(fā)芽抗性標記Vp1B3對部分供試材料的PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR products amplified by specific resistance to PHS markers Vp1B3 in several tested cultivars

2.3 四川小麥籽粒硬度和穗發(fā)芽抗性基因的分布

105份四川小麥品種籽粒硬度和穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因的分布如表2所示，聚合2項優(yōu)質(zhì)基因(同時含有Pinb-D1b和Vp-1Bc)的四川小麥品種有11份，分別為川麥55、川農(nóng)12、川農(nóng)18、綿陽35、綿麥43、國豪麥15、蓉麥2號、良麥4號、蜀麥375、渝麥7號和南麥302，頻率占全部品種的10.5 %。

3 討 論

3.1 優(yōu)質(zhì)籽粒硬度基因在四川小麥中的分布與組成形式

Giroux等[15]研究表明，硬質(zhì)小麥Cheyenne的質(zhì)地變化是由于其Pinb基因的第46位氨基酸由甘氨酸(G)突變?yōu)榻z氨酸(S)造成的。本研究顯示，四川小麥品種含Pinb-D1b(Pinb突變)的頻率較低，僅占10.5 %。其中，32份川麥、19份綿麥、18份川農(nóng)、10份川育、8份西科麥系列品種中含Pinb-D1b的材料分別僅有1、3、4、0、0份，頻率為3.1 %、15.8 %、22.2 %、0.0 %和0.0 %。陳鋒等[7]研究認為，中國小麥品種Pinb-D1b變異類型較多，占54.5 %，但西南區(qū)頻率較低，僅占19.2 %。不同地區(qū)的Pinb-D1b分布也不盡相同，陜西占57.4 %[18]，青海占15.2 %[19]。本研究中所采用的105份小麥品種基本涵蓋了2000年以來四川省的育成品種，能夠代表該省小麥的遺傳特征，檢測表明四川小麥品種Pinb-D1b頻率較低，與陳鋒等[7]結(jié)論一致，這不僅與自然地理環(huán)境和當?shù)氐娘嬍沉晳T有關(guān)，也與選育品種所選用的親本資源相關(guān)。在實際育種過程中，籽粒硬度已可通過硬度儀(單籽粒谷物特性測試儀，Single Kernel Characterization System，SKCS)等儀器快速進行表型選擇，今后四川小麥的籽粒硬度品質(zhì)育種，可多考慮引入含Pinb-D1b類型的材料，改善Puroindoline基因的遺傳多樣性，適度提升硬質(zhì)麥的比例。

表2 105份四川小麥籽粒硬度和穗發(fā)芽抗性的分子標記檢測結(jié)果

注：下劃線表示正向品質(zhì)效應基因。

Note: The gene names underlined mean genes with positive effect to noodle quality.

3.2 優(yōu)質(zhì)穗發(fā)芽抗性基因在四川小麥中的分布與組成形式

四川因小麥收獲期與雨季相接，近年來已成為小麥穗發(fā)芽的重災區(qū)，從本研究結(jié)果來看，抗穗發(fā)芽基因資源已經(jīng)在四川得到良好應用，含Vp-1Bc(抗穗發(fā)芽)的品種頻率占83.8 %，高于中國推廣小麥品種抗穗發(fā)芽的平均頻率(71.7 %)[14]，接近優(yōu)質(zhì)面條商品小麥澳白麥的水平(88.9 %)[20]。川麥、綿麥、川農(nóng)、川育、西科麥系列品種含Vp-1Bc的材料分別有23、17、17、10、7份，頻率為71.9 %、89.5 %、94.4 %、100.0 %和87.5 %。究其原因，可能是四川陰雨潮濕氣候較多，生產(chǎn)上種植的小麥品種在較大的選擇壓力下得以保留豐富的抗穗發(fā)芽基因資源，但也應看到，四川還缺少含Vp-1Bb(高抗穗發(fā)芽)基因資源的材料；同時，現(xiàn)有的抗穗發(fā)芽品種若遭遇連續(xù)遇雨的自然環(huán)境，其抗性表現(xiàn)也會出現(xiàn)很大差異，部分含Vp-1Bc(抗穗發(fā)芽)的品種依然大量出現(xiàn)穗發(fā)芽現(xiàn)象，這就要求育種家盡早開拓出新的穗發(fā)芽抗源。另一方面，紅粒[12]、白粒[13]小麥的抗穗發(fā)芽能力也不盡相同，一般來說，紅粒小麥較白粒休眠期更長，更抗穗發(fā)芽，但白粒小麥更受農(nóng)民親睞，充分挖掘現(xiàn)有的白?？顾氚l(fā)芽小麥材料就顯得更為重要。

3.3 聚合優(yōu)質(zhì)籽粒硬度和穗發(fā)芽抗性基因品種在四川小麥中的分布

聚合優(yōu)質(zhì)籽粒硬度和穗發(fā)芽抗性基因的四川小麥品種有川麥55等11份，頻率為10.5 %；但其中白粒品種僅有4份，分別為川麥55、綿陽35、國豪麥15和渝麥7號，僅占全部品種的3.8 %。上述品種可成為改良籽粒硬度和穗發(fā)芽抗性的寶貴資源材料，直接利用它們作為優(yōu)質(zhì)基因?qū)氲挠H本，可能是改良四川小麥品質(zhì)的捷徑。同時，也應看到，部分品種的實際磨粉品質(zhì)與基因檢測結(jié)果并不十分吻合，如川麥36和川麥39，是四川省審定的為數(shù)不多的強筋小麥品種，硬度值較高，但檢測結(jié)果是非Pinb-D1b類型的；在穗發(fā)芽抗性上，含抗穗發(fā)芽Vp-1Bc基因的綿麥367在實際生產(chǎn)中反而較感穗發(fā)芽。這充分說明籽粒硬度和穗發(fā)芽抗性均是由多基因位點控制的，實際品質(zhì)表現(xiàn)是多種基因共同作用的結(jié)果，繼續(xù)發(fā)掘其他相關(guān)基因位點的功能，才能更好地為分子標記輔助育種工作服務。

4 結(jié) 論

本研究檢測的105份四川小麥品種的籽粒硬度和穗發(fā)芽抗性基因組成具有豐富的多態(tài)性，在四川小麥品質(zhì)育種中逐步導入優(yōu)質(zhì)基因Pinb-D1b和Vp-1Bc，是綜合提高四川小麥品質(zhì)的有效途徑。

參考文獻：

[1]Humphreys D G, Noll J. Methods for characterization of preharvest sprouting resistance in a wheat breeding program[J]. Euphytica, 2002, 126:61-65.

[2]Morris C F. Puroindolines: the molecular genetic basis of wheat grain hardness[J]. Plant Molecular Biology, 2002, 48:633-647.

[3]Chen F, Beecher B, Morris C F. Physical mapping and a new variant ofPuroindolineb-2 genes in wheat[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2010, 120:745-751.

[4]夏蘭芹,何中虎,陳新民,等. 小麥硬度主效基因Pina和Pinb的克隆和序列分析[J]. 作物學報, 2003, 29(1):25-30.

[5]Morris C F, Bhave M. Reconciliation of D-genome puroindoline allele designations with current DNA sequence data[J]. Journal of Cereal Science, 2008, 48:277-287.

[6]Martin J M, Frohberg R C, Morris C F, et al. Milling and bread baking traits associated with puroindoline sequence type in hard red spring wheat[J]. Crop Science, 2001, 41:228-234.

[7]陳 鋒,錢森和,張 艷,等. 中國冬小麥puroindoline類型分布及其對溶劑保持力的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2005, 38(11):2173-2181.

[8]陳 鋒,陳東升,錢森和,等. Puroindoline基因?qū)Υ盒←溎シ奂梆z頭、面條品質(zhì)的影響[J]. 作物學報, 2006, 32(7):980-986.

[9]Li C D, Ni P X, Francki M, et al. Genes controlling seed dormancy and pre-harvest sprouting in a rice-wheat-barley comparison[J]. Functional & Integrative Genomics, 2004(4):84-93.

[10]McCarty D R, Hattori T, Carson C B, et al. The Viviparous-1 developmental gene of maize encodes a novel transcriptional activator[J]. Cell, 1991, 66:895-905.

[11]Bailey P C, McKibbin R S, Lenton J R, et al. Genetic map location for orthologousVP1 genes in wheat and rice[J]. Theoretical and Applied Genetics, 1999, 98:281-284.

[12]楊 燕,張春利,陳新民,等. 紅粒春小麥穗發(fā)芽抗性鑒定及相關(guān)分子標記的有效性驗證[J]. 麥類作物學報, 2011, 31(1):54-59.

[13]苗西磊,王德森,夏蘭芹,等. 白粒小麥品種(系)穗發(fā)芽抗性機制分析[J]. 麥類作物學報, 2011, 31(4):741-746.

[14]楊 燕,王曉麗,劉世鑫,等. 利用STS標記檢測我國小麥推廣品種的抗穗發(fā)芽基因型[J]. 華北農(nóng)學報, 2013, 28(3):183-188.

[15]Giroux M J, Morris C F. A glycine to serine change in puroindoline b is associated with wheat grain hardness and low levels of starch-surface friabilin[J]. Theoretical and Applied Genetics, 1997, 95:857- 864.

[16]Yang Y, Zhao X L, Xia L Q, et al. Development and validation of aViviparous-1 STS marker for pre-harvest sprouting tolerance in Chinese wheats[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2007, 115:971-980.

[17]Murray H G, Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight DNA[J]. Nucleic Acids Research, 1980(8):4321-4325.

[18]張 晶,張曉科,王可珍,等. 陜西小麥籽粒硬度及其基因型分析[J]. 麥類作物學報, 2011, 31(4):666-671.

[19]王雪玲,李建民,魏 樂,等. 青海小麥籽粒硬度等位變異研究[J]. 麥類作物學報, 2014, 34(1):23-27.

[20]李式昭,伍 玲,鄭建敏,等. 優(yōu)質(zhì)面條商品小麥澳白麥相關(guān)品質(zhì)基因的分子標記鑒定[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2012, 45(18):3677-3687.