閻 華，王 會(huì)，于 博*，黃升謀，李云捷，吳進(jìn)菊，李玉奇

(1.湖北文理學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，湖北 襄陽(yáng) 441053；2.襄陽(yáng)市中心醫(yī)院，湖北 襄陽(yáng) 441053)

【研究意義】鰣魚屬于長(zhǎng)江三鮮，其肉質(zhì)鮮美，成為餐桌上的美食，其野生資源因?yàn)闅夂蜃兓腿藶橐蛩赜绊懀呀?jīng)逐漸減少。鰣魚為濾食性魚類，主要以浮游生物為主食，有時(shí)亦食硅藻及其它有機(jī)物的碎屑。目前湖北省長(zhǎng)江沿線已形成了具有相當(dāng)規(guī)模的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，但養(yǎng)殖場(chǎng)主片面追求經(jīng)濟(jì)效益，高密度養(yǎng)殖和高蛋白餌料投喂鰣魚，造成鰣魚生長(zhǎng)環(huán)境惡化，并且忽視了預(yù)防疾病措施，使得鰣魚傳染性疾病比較嚴(yán)重，有些養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病率高達(dá)60 %以上?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近期湖北省武漢市一些養(yǎng)殖場(chǎng)爆發(fā)鰣魚疾病，其體表出現(xiàn)潰瘍，嚴(yán)重者口鼻充血、流血，解剖后內(nèi)臟肝、脾、腎腫大。經(jīng)過(guò)細(xì)菌分離鑒定主要是嗜水氣單胞菌的感染。嗜水氣單胞菌為革蘭陰性菌，屬于氣單胞菌科，氣單胞菌屬，廣泛分布于水體環(huán)境，是引起魚類運(yùn)動(dòng)性氣單胞菌敗血癥的主要病原體[1]。嗜水氣單胞菌目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在2種溶血性毒素，分別是溶血素和氣溶素，分別由ahh1和aerA基因編碼[2]。嗜水氣單胞菌中溶血性毒素會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，最終引發(fā)寄主細(xì)胞死亡。鰣魚血液中礦質(zhì)元素鐵可以和蛋白質(zhì)合成血紅蛋白，有助于紅細(xì)胞輸送氧氣和二氧化碳，同樣有助于免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，提高巨噬細(xì)胞的殺菌作用。而礦質(zhì)元素鐵也是病原微生物的生長(zhǎng)必須元素，有助于提高生長(zhǎng)速度?；诖?，水產(chǎn)動(dòng)物通過(guò)調(diào)控礦質(zhì)元素鐵相關(guān)基因表達(dá)和調(diào)節(jié)血液鐵元素濃度，從而抑制病原微生物的生長(zhǎng)。鐵調(diào)素蛋白主要由hepc基因表達(dá)，在魚體肝細(xì)胞中產(chǎn)生的抗菌肽，抑菌活性很強(qiáng)，這種蛋白主要和機(jī)體鐵元素聯(lián)合作用，因此其含量和鐵元素濃度有著重要的關(guān)系[3]。白細(xì)胞介素炎癥因子主要由il-6基因編碼，激活JAK3/STAT3(蛋白酪氨酸激酶/轉(zhuǎn)錄激活因子)信號(hào)通路從而促進(jìn)鐵調(diào)素基因表達(dá)，有助于鐵調(diào)素發(fā)揮生物學(xué)功能，從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[4]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本試驗(yàn)通過(guò)平板劃線培養(yǎng)的方法對(duì)染病鰣魚中溶血性嗜水氣單胞菌XF-6的分離純化鑒定，進(jìn)而檢測(cè)健康鰣魚感染嗜水氣單胞菌XF-6后對(duì)其機(jī)體鐵元素濃度變化和肝臟中hepc、il-6、jak3和stat3基因表達(dá)情況進(jìn)行分析，研究了溶血性嗜水氣單胞菌XF-6侵染鰣魚對(duì)其免疫系統(tǒng)的影響，【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】明確鐵元素相關(guān)基因和鐵元素濃度在受感染魚體應(yīng)對(duì)嗜水氣單胞菌XF-6侵染中的具體功能。

1 材料與方法

1.1 病料與病原菌的分離

染病鰣魚典型病癥為敗血癥，其主要癥狀為行動(dòng)遲緩和反應(yīng)遲鈍，攝食較少，嚴(yán)重的魚體口鼻充血和腹部出血。魚體解剖后可見(jiàn)其肝臟腫大，腎臟、腸道充血。在無(wú)菌條件下從染病鰣魚的肝臟取樣，營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板劃線分離，30 ℃培養(yǎng)24 h，目測(cè)菌落生長(zhǎng)情況，光滑、微凸、圓整、黃色或淡黃色，判定為疑似菌落。然后挑取單菌落在氣單胞菌選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行二次純化，純化后的菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。分離培養(yǎng)獲取的菌株低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原菌鑒定方法

病原菌生理生化和革蘭氏染色以及氧化酶檢測(cè)均使用法國(guó)梅里埃生物公司鑒定試劑條開(kāi)展，在VITEK-32 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀上進(jìn)行操作。

瓷器畫上構(gòu)圖，需要去掌握新彩的獨(dú)特料性，裝飾手法上也可以拜托很多工藝上的局限性，這樣會(huì)給裝飾帶來(lái)很多自由隨性且靈動(dòng)感十分強(qiáng)烈的繪畫風(fēng)格，從而也能形成自己獨(dú)特繪畫風(fēng)格。由于不同的裝飾對(duì)象，所以對(duì)于表現(xiàn)手法也要根據(jù)不同題材來(lái)做改變。當(dāng)對(duì)新彩料性有一定程度掌握，那繪畫的起稿也能較為靈活的變動(dòng)。從而使料可以適應(yīng)自我的感官表達(dá)，達(dá)到最理想的表達(dá)手法。

1.3 化學(xué)試劑和生物試劑盒

化學(xué)試劑從上海一基實(shí)業(yè)有限公司購(gòu)買，生物試劑盒從上海英諾生物科技有限公司購(gòu)買。引物和反應(yīng)條件是根據(jù)前人描述的方法[5]。引物是由大連寶生物工程公司合成見(jiàn)表1。

1.4 實(shí)驗(yàn)菌株DNA提取

PCR反應(yīng)包括3對(duì)引物。PCR反應(yīng)溶液(25 μl)包含:12.5 μlTaq酶，1.0 μl ahh1引物，1.0 μl aerA引物，0.2 μl 16 SrRNA引物和1 μl提取DNA，余量為雙蒸水。 PCR儀器(ABI-2720，美國(guó)貝登儀器公司)擴(kuò)增，采用下列條件:初始變性95 ℃，5 min。95 ℃,30 s，59 ℃,30 s，72 ℃，30 s，35個(gè)循環(huán)周期,最后72 ℃條件下延伸10 min。擴(kuò)增的DNA片段使用2 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行水平電泳，1×TAE緩沖區(qū)(0.04 M Tris,0.02 M醋酸,0.002 M Na2EDTA),100 V,45 min,使用8 μlPCR產(chǎn)物。凝膠使用1μl/mL溴化乙錠染色30 min,紫外線光照下觀察。基因大小標(biāo)準(zhǔn)品是采用100個(gè)堿基對(duì)的DNA梯度標(biāo)記物(上海啟發(fā)試驗(yàn)試劑有限公司)。

如表3所示,電池兩端電壓的下降值跟隨停充時(shí)間的延長(zhǎng)而加大,給予越長(zhǎng)的間歇時(shí)間,鋰離子電池的端電壓下降得越厲害,若供給的停充時(shí)間太長(zhǎng),又達(dá)不到快速充電的目標(biāo)。停充對(duì)正恒流與負(fù)脈沖的切換具有緩沖效果,還在一定程度上去除電池的極化效應(yīng),同時(shí)還實(shí)現(xiàn)了去極化的目的。

1.5 PCR條件

細(xì)菌DNA制備方法是根據(jù)制造商的DNA提取試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司)開(kāi)展。

根據(jù)《高壓直流換流站設(shè)計(jì)技術(shù)規(guī)定》(DL/T 5223—2005)，換流站閥廳結(jié)構(gòu)安全等級(jí)為一級(jí)，結(jié)構(gòu)重要性系數(shù)1.1。

1.6 試驗(yàn)用健康鰣魚

健康鰣魚從湖北省農(nóng)科院水產(chǎn)養(yǎng)殖基地購(gòu)買獲取，選擇外表健康的鰣魚幼體，幼魚平均重量是100 g，平均長(zhǎng)度是20 cm。然后將健康鰣魚隨機(jī)劃分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組有3個(gè)平行，每個(gè)平行有50尾，總計(jì)300尾。

1.7 嗜水氣單胞菌XF-6侵染鰣魚實(shí)驗(yàn)和收集實(shí)驗(yàn)樣本

將低溫保存的嗜水氣單胞菌XF-6菌株使用平板富集培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)24 h后，以0.65 %高溫高壓滅菌的生理鹽水稀釋成4.0×105cfu/mL的菌體，使用一次性注射器往實(shí)驗(yàn)組鰣魚腹腔注射0.1 mL的菌體。對(duì)照組注射0.1 mL的高溫高壓滅菌的0.65 %生理鹽水。注射完成后6，12，24，48，72，84，96 h每個(gè)平行收集3尾鰣魚，使用一次性注射器從鰣魚尾部靜脈抽血0.5～0.8 mL。抽血后鰣魚進(jìn)行解剖，獲得肝臟置于-80 ℃液氮中保存，用于后續(xù)研究。

1.8 血液中鐵元素濃度和載鐵蛋白濃度的檢測(cè)

從圖3可以看出，鰣魚受侵染后6～96 h時(shí)試驗(yàn)組和對(duì)照組相比較，血液鐵元素濃度出現(xiàn)減少，12，24和48 h時(shí)達(dá)到差異顯著(P<0.05)，但未達(dá)到差異極顯著(P<0.01)。

1.9 肝臟鐵元素濃度的檢測(cè)

作為農(nóng)墾首家派駐紀(jì)檢機(jī)構(gòu)，紀(jì)檢組積極轉(zhuǎn)換思想，牢記責(zé)任使命，找準(zhǔn)職責(zé)定位，理清工作思路，以嵌入工作開(kāi)展監(jiān)督執(zhí)紀(jì)，認(rèn)真履行工作職責(zé)。

1.10 鰣魚肝臟中鐵元素調(diào)控基因表達(dá)研究

本研究中相關(guān)數(shù)據(jù)使用SPSS18.0軟件開(kāi)展分析，以t檢驗(yàn)法來(lái)探討差異顯著性，P<0.01顯示為差異極顯著(以**表示)，P<0.05顯示為差異顯著(以*表示)[10]。本研究中相關(guān)數(shù)據(jù)均顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

表2 鰣魚鐵代謝相關(guān)基因熒光定量PCR引物序列

圖1 染病鰣魚肝臟中分離得到的細(xì)菌XF-6培養(yǎng)形態(tài)Fig.1 Bacterial culture morphology of strain XF-6 isolated from infected fishes

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算相關(guān)數(shù)據(jù)

以鰣魚hepc基因cDNA序列、il-6基因cDNA序列，jak3基因cDNA序列、草魚stat3基因cDNA序列設(shè)計(jì)相關(guān)引物(表2)[7-9]。使用RNAiso提取試劑盒(大連寶生物工程有限公司)制備鰣魚肝臟總RNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)定量?jī)x(T-100，美國(guó)伯樂(lè)儀器有限公司)中對(duì)這幾個(gè)基因序列進(jìn)行QR-PCR。這4種基因的相對(duì)表達(dá)量采用2分法進(jìn)行計(jì)算，以鰣魚18SrRNA基因的表達(dá)量為基準(zhǔn)。QR-PCR反應(yīng)溶液包含：10.0 μlTaq酶，0.4 μl引物，2 μl cDNA模板，7.2 μl ddH2O，總體積20 μl。采用下列條件進(jìn)行擴(kuò)增：初始變性95 ℃，1 min；95 ℃變性5 s；60 ℃退火20 s；72 ℃延伸20 s；循環(huán)35個(gè)周期；每個(gè)樣本溶解曲線從52～99 ℃平行檢測(cè)3次。

取100 mL山羊乳85℃滅菌15 min，冷卻至45℃，接種乳酸菌，42℃發(fā)酵后4℃冷藏12 h，沸水浴滅酶10 min，4℃ 4 000×g離心10 min，取上清液，4℃冷藏備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落特征

從圖5可以看出，嗜水氣單胞菌XF-6侵染鰣魚后6～96 h時(shí)試驗(yàn)組和對(duì)照組相比較，肝臟鐵元素濃度出現(xiàn)增加，但是沒(méi)有達(dá)到差異顯著(P>0.05)。

M:DNA標(biāo)準(zhǔn)品，1:嗜水氣單胞菌XF-6 圖2 染病鰣魚分離得到的溶血性嗜水氣單胞菌XF-6多重PCR檢測(cè)Fig.2 Multiplex PCR assay of hemolytic disease shad Aeromonas hydrophila XF-6

2.2 生理生化反應(yīng)及鑒定結(jié)果

經(jīng)純化分離后的致病病原菌XF-6，使用VITEK-32全自動(dòng)細(xì)菌分析儀進(jìn)行生理生化特征操作，鑒定結(jié)果為嗜水氣單胞菌，生理、生化特性具體見(jiàn)表3。

2.3 嗜水氣單胞菌XF-6溶血性毒素因子ahh1和aerA的基因分析

從圖2可以看出，經(jīng)過(guò)多重PCR檢測(cè)證實(shí),從染病鰣魚中分離得到的嗜水氣單胞菌XF-6攜帶有ahh1和aerA基因。該細(xì)菌16srRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(439個(gè)堿基對(duì)) ，ahh1基因擴(kuò)增產(chǎn)物(153個(gè)堿基對(duì))，aerA基因擴(kuò)增產(chǎn)物(314個(gè)堿基對(duì))。

使用干法消化的方法測(cè)定肝臟鐵元素濃度[6]：鰣魚肝臟解凍完成后，使用高溫高壓滅菌的生理鹽水沖洗3次，然后使用濾紙吸干，稱重后放入瓷干鍋，以600 ℃高溫馬弗爐灼燒約5 h，樣本出現(xiàn)白色或者灰白色時(shí)，自然冷卻到室溫取出來(lái)，然后加入1︰1的硝酸水混合溶液5 mL，電爐上消化至沸騰，使用濾紙過(guò)濾消化液流入50 mL容量瓶，再以雙蒸水反復(fù)沖洗坩堝以及濾紙，使用濾紙過(guò)濾流入上述容量瓶，最后使用雙蒸水定容至刻度，檢測(cè)備用。使用ICP-AES儀(ICP-8000，北京達(dá)豐瑞儀器有限公司)重復(fù)測(cè)定上述樣本3次。

表3 菌株XF-6生理生化特性

* 顯著性差異(P<0.05)圖3 嗜水氣單胞菌XF-6侵染鰣魚后不同時(shí)間點(diǎn)血清鐵濃度的變化Fig.3 Changes of serum iron concentration of Aeromonas hydrophila XF-6 infection at different time points

圖4 嗜水氣單胞菌XF-6侵染鰣魚后不同時(shí)間點(diǎn)血清總鐵結(jié)合力的變化Fig.4 Changes of total iron binding capacity in serum of Aeromonas hydrophila XF-6 infection at different time points

2.4 嗜水氣單胞菌XF-6侵染鰣魚后其血液鐵元素濃度的變化

血液鐵元素濃度和載鐵蛋白濃度的檢測(cè)是根據(jù)制造商的血液鐵元素濃度和載鐵蛋白濃度檢測(cè)試劑盒的產(chǎn)品說(shuō)明書開(kāi)展(武漢利樂(lè)生物工程有限公司)。以紫外分光光度計(jì)(TU-1900，北京普析通用儀器有限公司)重復(fù)測(cè)定樣本3次。

2.5 嗜水氣單胞菌XF-6侵染鰣魚后其血液載鐵蛋白濃度的變化

從圖4可以看出，鰣魚受侵染后6～96 h血液載鐵蛋白濃度實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比較，載鐵蛋白濃度有所增加，但是均沒(méi)有達(dá)到差異顯著(P>0.05)。

2.6 嗜水氣單胞菌XF-6侵染鰣魚后其肝臟鐵元素濃度的變化

從染病鰣魚的肝臟樣本中分離得到一株致病病原菌，命名為XF-6，24 h營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上可見(jiàn)其菌落為黃色、濕潤(rùn)，圓形，略隆起、邊緣整齊，并帶有特殊芳香氣味，革蘭氏染色為陰性桿菌(圖1)。

圖5 嗜水氣單胞菌XF-6侵染鰣魚后不同時(shí)間點(diǎn)肝臟鐵濃度的變化Fig.5 Changes of hepatic iron concentration of Aeromonas hydrophila XF-6 infection at different time points

2.7 嗜水氣單胞菌XF-6侵染鰣魚后其肝臟hepc、il-6、jak3、stat3基因表達(dá)的變化

從圖6可以看出，鰣魚受到嗜水氣單胞菌XF-6侵染后，其肝臟hepc基因在6～96 h時(shí)和0 h時(shí)的表達(dá)量比較出現(xiàn)增加，6 h時(shí)增加量最大，6、12、24 h時(shí)達(dá)到差異顯著(P<0.05)，但未達(dá)到差異極顯著(P<0.01)。其肝臟il-6基因在6～96 h時(shí)和0 h時(shí)的表達(dá)量比較出現(xiàn)增加，24 h時(shí)增加量最大，12、24、48 h時(shí)達(dá)到差異顯著(P<0.05)，但未達(dá)到差異極顯著(P<0.01)。其肝臟jak3基因在6～96 h時(shí)和0 h時(shí)的表達(dá)量比較出現(xiàn)增加，12 h時(shí)增加量最大，12、24 h達(dá)到差異顯著(P<0.05)，但未達(dá)到差異極顯著(P<0.01)。其肝臟stat3基因在6～96 h時(shí)和0 h時(shí)的表達(dá)量比較出現(xiàn)增加，6 h時(shí)的增加量最大，6、12、24 h時(shí)達(dá)到差異顯著(P<0.05)，但未達(dá)到差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

采用平板劃線培養(yǎng)的方法對(duì)染病鰣魚肝臟進(jìn)行致病菌的分離純化，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上獲得形態(tài)完全一致的菌落，將該菌株命名為XF-6。全自動(dòng)細(xì)菌分析儀鑒定結(jié)果為嗜水氣單胞菌。嗜水氣單胞菌XF-6人工感染鰣魚試驗(yàn)，出現(xiàn)的癥狀與自然病例基本相同，再鑒定的菌株與接種菌株完全一致，所觀察到的菌落形態(tài)也基本相符。該菌具有溶血性嗜水氣單胞菌的典型特征，能分泌具有溶血性、腸毒性和細(xì)胞毒性的毒素因子，并能廣泛地侵襲健康鰣魚腎、脾、肺、肝、肌肉和血液等組織器官，造成廣泛性出血和全身性器官病變，包括出現(xiàn)腫脹、顆粒變性、玻璃樣變，壞死崩解以及紅細(xì)胞破裂。染病鰣魚肉眼觀察體表出現(xiàn)潰瘍、疤痕，嚴(yán)重的產(chǎn)生口鼻充血、流血，解剖后其內(nèi)臟肝、脾、腎腫大，腸道充血。在最近幾年，多重PCR由于其具有速度快，高敏感性和特異性等特點(diǎn)，已經(jīng)成為檢測(cè)病原體首選的方法[11]。在本研究中，使用特定的ahh1和aerA引物證實(shí)了嗜水氣單胞菌XF-6攜帶有氣溶素和溶血素基因，從而為其特征性疾病鑒定奠定良好的基礎(chǔ)。

從根本屬性上來(lái)說(shuō)，教師生態(tài)系統(tǒng)是不斷變化并能夠自我調(diào)節(jié)的非完全人工生態(tài)系統(tǒng)。教師個(gè)人的專業(yè)發(fā)展需要有機(jī)協(xié)調(diào)好系統(tǒng)當(dāng)中內(nèi)部與外部生態(tài)環(huán)境間的關(guān)系。在內(nèi)部環(huán)境中，教師的專業(yè)能力、理論知識(shí)、心理素養(yǎng)、職業(yè)操守等都將會(huì)直接影響他們的專業(yè)發(fā)展。而在外部環(huán)境中，院校環(huán)境(校內(nèi)環(huán)境、管理機(jī)制、教師團(tuán)隊(duì)文化等)與校外環(huán)境(社會(huì)政治、文化、經(jīng)濟(jì)以及相關(guān)英語(yǔ)研究機(jī)構(gòu)的綜合水平及服務(wù)水平等)同樣會(huì)影響廣大教師的專業(yè)發(fā)展。因此，高職英語(yǔ)教師需要協(xié)調(diào)好個(gè)人、院校、社會(huì)之間的關(guān)系，明確個(gè)體與集體的利益關(guān)系，精準(zhǔn)找到現(xiàn)階段與未來(lái)發(fā)展之間的平衡點(diǎn)，只有這樣，才能確保自身專業(yè)發(fā)展的可持續(xù)性。

* 顯著性差異(P<0.05)圖6 嗜水氣單胞菌XF-6侵染鰣魚后不同時(shí)間點(diǎn)hepc,il-6,jak3,stat3基因表達(dá)的變化Fig.6 hepc,i-6, jak3, stat3 gene expression changes of Aeromonas hydrophila XF-6 infection at different time points

鰣魚血液中鐵元素可以參與機(jī)體多種酶類的合成，同時(shí)也合成血紅蛋白，作為氧氣和二氧化碳運(yùn)輸載體，同時(shí)也有助于免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，提高巨噬細(xì)胞的吞噬作用。而礦質(zhì)元素鐵也是病原微生物生長(zhǎng)必需元素，有助于提高其生長(zhǎng)速度。致病菌和寄主鰣魚之間通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)作用，可以在鐵元素濃度上面達(dá)到平衡狀態(tài)。通過(guò)鐵元素相關(guān)基因調(diào)節(jié)作用，減少機(jī)體游離鐵元素濃度，增加結(jié)合鐵元素濃度，從而降低致病菌的生長(zhǎng)速度以減少其危害程度。本試驗(yàn)對(duì)鰣魚機(jī)體鐵元素濃度和載鐵蛋白濃度的比較表明，鰣魚受到嗜水氣單胞菌XF-6侵染后，其血液鰣魚血液鐵元素濃度減少，12、24、48 h時(shí)達(dá)到差異顯著；鰣魚肝臟鐵元素濃度有所增加，但是沒(méi)有達(dá)到差異顯著。這證明鰣魚受到病原菌侵染后，可以進(jìn)行自我調(diào)節(jié)，減少機(jī)體的鐵元素循環(huán)作用，從而抑制病原菌的生長(zhǎng)。鰣魚受到病原菌侵染后其血液載鐵蛋白濃度有所增加，但是和對(duì)照組比較沒(méi)有達(dá)到差異顯著。綜合分析，血液鐵元素濃度和載鐵蛋白濃度的比值顯著降低，從而降低嗜水氣單胞菌XF-6生長(zhǎng)過(guò)程中從鰣魚體內(nèi)獲取鐵元素的能力。

本研究檢測(cè)到鰣魚受到嗜水氣單胞菌XF-6侵染后，其肝臟hepc、il-6、jak3和stat3基因表達(dá)量顯著增加，證明這些基因有助于鰣魚機(jī)體的免疫反應(yīng)，具有免疫調(diào)節(jié)作用，從而調(diào)控體內(nèi)鐵元素濃度。hepc基因的表達(dá)產(chǎn)物有助于抑制腸道鐵元素的吸收和肝臟鐵的釋放以降低游離鐵元素濃度。前人研究發(fā)現(xiàn)，大菱鲆受到嗜水氣單胞菌侵染后，肝、脾、鰓等組織器官hepc基因的表達(dá)量在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)有顯著性提高。鱸魚受到鏈球菌侵染后，肝細(xì)胞hepc基因mRNA水平在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)明顯增加。香魚受到鰻利斯頓氏菌侵染后，肝臟中hepc基因表達(dá)量在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)顯著增加[10-12]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果和前人比較一致，hepc基因在受到嗜水氣單胞菌XF-6侵染后，表達(dá)量有所增加，6、12、24 h時(shí)達(dá)到差異顯著。同樣，鰣魚受到嗜水氣單胞菌XF-6侵染后，免疫細(xì)胞會(huì)第一時(shí)間合成和分泌白細(xì)胞介素6(il-6)炎性因子，其濃度大小和受感染程度密切相關(guān)。il-6炎性因子通過(guò)免疫應(yīng)答作用調(diào)控hepc基因的表達(dá)水平，從而控制鰣魚鐵元素濃度。il-6炎性因子結(jié)合小分子受體后可激活jak3基因，然后激活stat3基因，最后調(diào)控hepc基因的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，鰣魚受到嗜水氣單胞菌XF-6侵染后，其肝臟il-6基因在6～96 h時(shí)和0 h時(shí)的表達(dá)量比較出現(xiàn)增加，24 h時(shí)增加量最大，12、24、48 h時(shí)達(dá)到差異顯著(P<0.05)，但未達(dá)到差異極顯著(P<0.01)。其肝臟jak3基因在6～96 h時(shí)和0 h時(shí)的表達(dá)量比較出現(xiàn)增加，12 h時(shí)增加量最大，12、24 h達(dá)到差異顯著(P<0.05)，但未達(dá)到差異極顯著(P<0.01)。其肝臟stat3基因在6～96 h時(shí)和0 h時(shí)的表達(dá)量比較出現(xiàn)增加，6 h時(shí)的增加量最大，6、12、24 h時(shí)達(dá)到差異顯著(P<0.05)，但未達(dá)到差異極顯著(P<0.01)。上述結(jié)果表明，鰣魚受到嗜水氣單胞菌XF-6侵染后，其機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)，il-6基因影響到j(luò)ak3和stat3基因的表達(dá)，最后hepc基因的表達(dá)量增加，從而調(diào)控機(jī)體鐵元素濃度，降低病原菌生長(zhǎng)速度，減少其危害程度。

4 結(jié) 論

染病鰣魚肝臟中分離得到病原菌XF-6，經(jīng)VITEK-32全自動(dòng)細(xì)菌分析儀鑒定結(jié)果為嗜水氣單胞菌。采用多重PCR方法確認(rèn)嗜水氣單胞菌XF-6屬于溶血性嗜水氣單胞菌，含有氣溶素基因(aerA)和溶血素基因(ahh1)。侵染嗜水氣單胞菌XF-6后，鰣魚血清中鐵濃度明顯降低，在12、24、48 h時(shí)顯著低于對(duì)照組；血清中總鐵結(jié)合力有所上升，但沒(méi)有達(dá)到顯著水平；肝臟中鐵濃度相對(duì)于對(duì)照組沒(méi)有達(dá)到顯著性差異水平，但仍有升高。肝臟中hepc基因的表達(dá)量在6、12、24 h時(shí)顯著上升；肝臟中il-6基因的表達(dá)量在12、24、48 h時(shí)顯著上升、肝臟中jak3基因的表達(dá)量在12、24 h時(shí)顯著上升，肝臟中stat3基因的表達(dá)量在6、12、24 h時(shí)顯著上升。

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