姜新強(qiáng)，李璐璐，劉慶超，劉慶華，王奎玲*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與林學(xué)院，山東 青島 266109; 2.北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，北京 100083)

小葉蚊母樹(Distyliumbuxifolium)是金縷梅科蚊母樹屬常綠小灌木，在亞熱帶地區(qū)分布廣泛，其葉色濃綠，早春2—4月開花，花朵紫紅色，花量大，觀賞價值較高，廣泛用于室內(nèi)外園林綠化[1]，已在南京等地成功引種栽培[2]。秋冬季節(jié)持續(xù)低溫是小葉蚊母樹在北方地區(qū)露地栽植應(yīng)用的主要限制因子。低溫能夠破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，造成植物體內(nèi)代謝失調(diào)[3]，影響正常的生長發(fā)育，嚴(yán)重時造成植物死亡。然而，當(dāng)植物遭受低溫脅迫時，植物可以通過改變其組織器官的形態(tài)結(jié)構(gòu)[4]和多種代謝途徑來抵抗所受到的低溫脅迫，包括滲透保護(hù)物質(zhì)的積累、抗氧化酶系統(tǒng)的激活以及抗逆蛋白質(zhì)的合成等方面[5-6]。小葉蚊母樹具有一定的抗寒性，其葉片半致死溫度為-6.23 ℃[7]。明確小葉蚊母樹葉片在低溫下的生理適應(yīng)機(jī)制對于揭示其耐寒機(jī)制和篩選抗寒種質(zhì)資源具有十分重要的意義。鑒于此，以自杭州引種至青島地區(qū)露地栽培的小葉蚊母樹為試驗(yàn)材料，通過測定其在秋冬季節(jié)自然變溫過程中不同時期葉片組織結(jié)構(gòu)、葉片相對電導(dǎo)率和相關(guān)生理指標(biāo)的變化，探究小葉蚊母樹的抗寒性和對自然變溫的適應(yīng)機(jī)制，為其北引栽培和培育耐寒種質(zhì)提供詳實(shí)的科學(xué)依據(jù)和理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為 2 年生小葉蚊母樹植株，露地栽植于即墨市普東鎮(zhèn)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地中。2015年10月至2016年4月每月中旬在天氣晴朗的上午10:00—12:00進(jìn)行取樣。在30株小葉蚊母樹中選取生長健壯、受光均勻的3株植株，每株取向陽面枝條頂端向下第4節(jié)生長健壯的成熟葉片15片，隨機(jī)分為3個重復(fù)，每個重復(fù)取5片葉片用于觀察葉片組織結(jié)構(gòu)。試驗(yàn)期間月平均最低溫度分別為17、11、4、-2、-7、-2、3 ℃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 相對電導(dǎo)率及生理指標(biāo)測定 取1.1中葉片用于電導(dǎo)率和生理指標(biāo)的測定。參照趙世杰等[8]的方法測定小葉蚊母樹葉片相對電導(dǎo)率；葉片丙二醛(MDA)、可溶性蛋白和脯氨酸含量測定參考王學(xué)奎[9]的方法；超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定參考Giannopolitis等[10]的方法，以每單位時間內(nèi)抑制光還原50%的四氮唑藍(lán)(NBT)為1個酶活性單位，5個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 葉片組織結(jié)構(gòu)觀測 采用常規(guī)石蠟切片法觀察小葉蚊母樹葉片組織結(jié)構(gòu)，用蒸餾水沖洗葉片，在主脈及兩側(cè)取0.5 cm×1.0 cm樣品，保存于FAA固定液中，真空泵抽氣后備用。切片厚度為8 μm，番紅、固綠雙重染色后用中性樹膠封片，在Olympus CX31(CX31, Olympus, Japan)光學(xué)顯微鏡下觀察，每個樣品統(tǒng)計(jì)2個視野，每個月份統(tǒng)計(jì)30張照片。用Image J軟件測量葉片中脈厚度，葉片厚度，上、下表皮細(xì)胞厚度，柵欄組織厚度，海綿組織厚度。參考Lianopoulou等[11]的方法，計(jì)算柵欄組織相對體積比，海綿組織相對體積比，上、下表皮細(xì)胞相對體積比。參考馬建靜等[12]的方法，計(jì)算細(xì)胞體積與細(xì)胞長寬比。

上表皮細(xì)胞相對體積比=上表皮細(xì)胞厚度/葉片厚度×100%,

下表皮細(xì)胞相對體積比=下表皮細(xì)胞厚度/葉片厚度×100%,

柵欄組織相對體積比=柵欄組織厚度/葉片厚度×100%,

海綿組織相對體積比=海綿組織厚度/葉片厚度×100%,

細(xì)胞體積= π·(細(xì)胞寬度/2)2×細(xì)胞長度(0.38+0.117×細(xì)胞長度/細(xì)胞寬度),

細(xì)胞長寬比=細(xì)胞長度/細(xì)胞寬度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均通過Excel 2013進(jìn)行整理，利用SPSS 21.0進(jìn)行差異顯著性分析。采用單因素(one-way ANOVA) 和最小顯著差異法(LSD)進(jìn)行方差分析和多重比較(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然變溫過程中的細(xì)胞膜透性的變化

由圖1可知，2016年2月以前，隨著月平均最低溫度的降低，葉片相對電導(dǎo)率呈現(xiàn)升高的趨勢，2016年2月(月平均最低氣溫為-7 ℃)葉片相對電導(dǎo)率最高，為58.90%，相比于2015年10月升高了276.88%，顯著高于其他時期。2016年3月和4月，隨著月平均最低溫度的上升，小葉蚊母樹葉片相對電導(dǎo)率下降，分別降至27.34%和23.23%。

不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P≤0.05)，下同

圖12015年10月至2016年4月月平均最低溫度和小葉蚊母樹葉片相對電導(dǎo)率

2.2 自然變溫過程中的葉片生理指標(biāo)的變化

如圖2所示，小葉蚊母樹葉片SOD活性、MDA、可溶性蛋白和脯氨酸含量均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。2016年2月和3月葉片SOD活性顯著高于其他月份，2016年3月SOD活性分別為2015年10月和2016年4月的1.67和1.73倍；MDA和脯氨酸含量最大值均出現(xiàn)在2016年2月，分別為14.34 μmol/g和226.16 μg/g，均顯著高于其他月份，MDA 含量最低值出現(xiàn)在2016年3月，為5.64 μmol/g，脯氨酸含量最低值為98.73 μg/g，出現(xiàn)在2015年10月；2016年1—2月的葉片可溶性蛋白含量顯著高于其他時期。

2.3 自然變溫過程中的葉片組織結(jié)構(gòu)的變化

選取小葉蚊母樹2015年10月、2016年1月和4月葉片對其組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行切片觀察，結(jié)果見圖3。

圖2 2015年10月至2016年4月小葉蚊母樹葉片生理指標(biāo)的變化

由圖3可以看出，小葉蚊母樹葉片為不等面葉，不同時期葉片均由上表皮細(xì)胞、柵欄組織、海綿組織和下表皮細(xì)胞構(gòu)成，維管束由木質(zhì)部和韌皮部組成。葉脈維管束為半圓形，韌皮部外側(cè)有木化的韌皮纖維。2015年10月葉片柵欄組織細(xì)胞排列較疏松(圖3A、D)，細(xì)胞間隙較大，2016年1月(圖3B、E) 和4月(圖3C、F) 葉片柵欄組織細(xì)胞排列較緊密。2016年1月葉脈皮層組織出現(xiàn)分層現(xiàn)象(圖3B)，細(xì)胞從排列最松散處分開且向四周擴(kuò)展形成空隙(圖3B、C框內(nèi))，2016年4月空隙變小。

A—C 分別為2015年10月、2016年1月和2016年4月小葉蚊母樹葉中脈解剖結(jié)構(gòu)；D—F 分別為2015年10月、2016年1月和2016年4月小葉蚊母樹葉葉肉解剖結(jié)構(gòu)。X:木質(zhì)部細(xì)胞; P:韌皮部細(xì)胞; UE:上表皮細(xì)胞; PP:柵欄組織細(xì)胞; PF:纖維細(xì)胞; SP:海綿組織細(xì)胞; LE:下表皮細(xì)胞

圖4 自然變溫過程中小葉蚊母樹葉片解剖結(jié)構(gòu)特征

對自然變溫過程中小葉蚊母樹葉片中脈厚度，葉片厚度，上、下表皮細(xì)胞厚度，柵欄組織厚度，海綿組織厚度，柵欄組織相對體積比，海綿組織相對體積比，上表皮細(xì)胞相對體積比，下表皮細(xì)胞相對體積比等11個指標(biāo)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖4所示。2016年1月葉片厚度顯著高于2015年10月和2016年4月，相比于2015年10月葉片厚度增加了27.7%，達(dá)到373.35 μm；2015年10月、2016年1月和2016年4月小葉蚊母樹葉中脈厚度無顯著性變化，最高值出現(xiàn)在2016年4月，為583.02 μm(圖4a)。小葉蚊母樹不同時期上、下表皮細(xì)胞、柵欄組織和海綿組織在葉片中所占體積不同(圖4b)。2015年10月柵欄組織相對體積比顯著低于2016年1月和4月，而海綿組織相對體積比顯著高于2016年1月和4月；上表皮細(xì)胞相對體積比最大值出現(xiàn)在2016年4月，為7.1%，顯著高于2015年10月(5.8%) 和2016年1月(6.0%)，2016年1月和4月下表皮細(xì)胞相對體積比均為4.3%，顯著高于2015年10月(3.7%)；2016年4月海綿組織體積最大，為5 177.92 μm3(圖4c)，2016年1月和4月柵欄組織細(xì)胞體積顯著高于2015年10月(圖4c)；柵欄組織細(xì)胞長寬比最大值出現(xiàn)在2016年1月(1.30)，顯著高于2016年4月(圖4d)，與2015年10月之間無顯著性差異；2016年4月海綿組織細(xì)胞長寬比顯著高于2015年10月和2016年1月(圖4d)。

3 結(jié)論與討論

溫度與植物的生長、發(fā)育、開花、結(jié)實(shí)等生物學(xué)過程密切相關(guān)，是影響植物生長發(fā)育的重要環(huán)境因子，貫穿于植物生長的全部過程。在低溫脅迫下，植物細(xì)胞和組織穩(wěn)定性遭到破壞，葉片表現(xiàn)出萎篶、凍斑、焦枯，枝條變黑等受害癥狀[13]。但是經(jīng)過短暫或長期的低溫馴化后，植物也可以通過改變自身細(xì)胞、組織結(jié)構(gòu)和生理代謝過程以增強(qiáng)細(xì)胞和組織穩(wěn)定性，提高對低溫環(huán)境的適應(yīng)性。本研究對自然變溫過程中的小葉蚊母樹的葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理指標(biāo)變化進(jìn)行了觀測，發(fā)現(xiàn)其可以通過改變自身組織結(jié)構(gòu)和積累生理代謝性物質(zhì)以提高對低溫環(huán)境的適應(yīng)能力。

植物葉片是進(jìn)行光合作用的主要器官，對溫度敏感且可塑性較大。葉片可以通過自身組織結(jié)構(gòu)的改變以增強(qiáng)對低溫環(huán)境適應(yīng)性[14-15]。研究表明，擬南芥葉片暴露在低溫中15 d，葉片解剖結(jié)構(gòu)就會發(fā)生不可逆的改變以適應(yīng)低溫環(huán)境[16]。對木本植物腰果(Anacardiumoccidentale)[17]、北海道黃楊(Euonymusjaponicus‘Cu Zhi’)[18]和油棕(Elaeisguineensis)[19]的研究均表明，低溫能夠使葉片結(jié)構(gòu)出現(xiàn)適應(yīng)性的變化，如葉片厚度增大，組織緊密度增加等以適應(yīng)低溫環(huán)境。本研究對小葉蚊母樹2015年10月、2016年1月和4月葉組織結(jié)構(gòu)不同參數(shù)的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在溫度較低的2016年1月(平均最低溫度-7 ℃)，小葉蚊母樹葉片厚度、柵欄組織細(xì)胞體積顯著高于溫度較高的2015年10月。隨著溫度的降低，小葉蚊母樹葉片結(jié)構(gòu)發(fā)生了對低溫的適應(yīng)性變化，并且葉片厚度的增加主要是由于葉片柵欄組織厚度增加。冬季(2016年1月)小葉蚊母樹葉片厚度和柵欄組織在葉片中所占比重增大能增強(qiáng)低溫環(huán)境中葉片對光能的利用效率以增加固碳能力，提高對低溫逆境的抵抗能力。柵欄組織厚度的增加是小葉蚊母樹適應(yīng)低溫環(huán)境的一種適應(yīng)性表現(xiàn)，這與Poorter等[20]和Scheepens等[21]的研究結(jié)果一致。除細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變外，植物葉片對低脅迫的適應(yīng)性還體現(xiàn)在葉肉細(xì)胞生長模式和細(xì)胞尺寸上。Stefanowska等[22]研究表明，歐洲油菜(Brassicanapus)葉片在零度以上的低溫脅迫下，柵欄組織會由平行于葉表面方向伸長轉(zhuǎn)向垂直于葉表面方向伸長，葉肉細(xì)胞體積也會增大。小葉蚊母樹不同時期葉肉細(xì)胞體積與長寬比變化趨勢一致，由此推測冬季植物葉片柵欄組織細(xì)胞體積的增大原因可能是由于柵欄組織細(xì)胞垂直于葉片方向的生長。

除葉片組織結(jié)構(gòu)之外，植物還可以通過改變自身生理代謝物質(zhì)以增強(qiáng)自身抗寒性。葉片相對電導(dǎo)率和MDA含量是衡量植物抗寒性的重要指標(biāo)，相對電導(dǎo)率反映了細(xì)胞電解液泄露程度，MDA是細(xì)胞膜過氧化的產(chǎn)物，其含量可以反映細(xì)胞膜受害程度。2015年11月葉片 MDA 含量顯著高于2015年10月，并且在2015年10月至2016年2月期間維持在較高水平，說明在此期間細(xì)胞膜受到損傷，MDA 積累。2016年2月小葉蚊母樹葉片相對電導(dǎo)率和MDA含量達(dá)到最大值，表明在此期間細(xì)胞膜受害程度和細(xì)胞電解液外泄程度最高，細(xì)胞受害最嚴(yán)重。

植物在遭受低溫、干旱等非生物脅迫時，會積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，主動提高細(xì)胞對不良環(huán)境的抵抗能力[11]。在低溫脅迫時，細(xì)胞內(nèi)活性氧含量升高，造成細(xì)胞膜過氧化，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能[23]。而SOD能有效清除細(xì)胞體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧[24]，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性。在自然變溫期間，小葉蚊母樹葉片SOD活性呈先升高后降低的趨勢，溫度比較低的2016年2月和3月 SOD 活性顯著高于其他時期，表明在此時期細(xì)胞對活性氧的清除能力提高，細(xì)胞自身的生理代謝能力增強(qiáng)；2016年3月MDA含量顯著降低，這可能與3月小葉蚊母樹葉片中SOD活性較高有關(guān)，較高活性的SOD降低了細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化水平?？扇苄缘鞍缀康脑黾佑欣谔岣呒?xì)胞內(nèi)束縛水含量，從而降低冰點(diǎn)[25]。2016年1月和2月葉片可溶性蛋白含量顯著高于其他時期，這是由于植物通過葉片中可溶性蛋白的積累以增加防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰的能力。作為細(xì)胞內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在低溫脅迫下，可溶性蛋白和脯氨酸含量的增加可以增加細(xì)胞液濃度，降低細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰溫度[26-27]。除了具有維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓、結(jié)合蛋白質(zhì)以保護(hù)蛋白活性的功能外，脯氨酸還具有清除羥基自由基、保護(hù)細(xì)胞膜的功能[28]。對冬青(Ilexchinensis)[25]和櫻桃(Cerasuspseudocerasus)[29]的研究表明，葉片內(nèi)脯氨酸含量在低溫脅迫下均升高，與本研究結(jié)果一致。小葉蚊母樹脯氨酸含量的最大值出現(xiàn)在2016年2月，顯著高于其他時期，表明在此時期脯氨酸作為一種滲透條件物質(zhì)，能夠提高細(xì)胞液濃度，減弱低溫對細(xì)胞的傷害。

本研究通過揭示小葉蚊母樹在北方地區(qū)秋冬季節(jié)自然變溫過程中葉片結(jié)構(gòu)和生理指標(biāo)的變化，明確了小葉蚊母樹葉片能夠通過改變組織結(jié)構(gòu)、主動積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和提高抗氧化物酶活性等機(jī)制提高自身對低溫環(huán)境的適應(yīng)能力，揭示了小葉蚊母樹葉片越冬過程中的低溫適應(yīng)機(jī)制。但植物對低溫的適應(yīng)性狀是數(shù)量性狀，并且露地栽培過程中多種環(huán)境因素都會對其造成影響，對小葉蚊母樹在引種地僅進(jìn)行了1 a的低溫適應(yīng)性觀測，未來還需要對引種植株進(jìn)行更為全面的觀測，以明確其在低溫下的適應(yīng)性。

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