李亞男 ，李 敏 ，姜 磊 ，欒曉輝 ，梁 娜 ，徐倩男 ，張家碩 ，5，唐銘池 ，邊英男 ，陳麗琴

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063；3.溫州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系，浙江 溫州 325035；4.基納生物技術(shù)（上海）有限公司，上海 200032；5.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)系，江蘇 蘇州 215123；6.哈爾濱市公安局道里分局刑事技術(shù)大隊(duì)，黑龍江 哈爾濱 150070）

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）遺傳標(biāo)記因其突變率低、擴(kuò)增子短等優(yōu)勢(shì)而備受法醫(yī)遺傳學(xué)界關(guān)注，有望在高度降解檢材檢驗(yàn)、特殊親權(quán)關(guān)系鑒定和表型特征推斷等方面發(fā)揮獨(dú)特作用[1-11]。常見的SNP分型檢驗(yàn)方法有SNaPshot微測(cè)序[12]、TaqMan 探針[13]、DNA 芯片[14]、焦磷酸測(cè)序[15]、高通量測(cè)序[16]和DNA質(zhì)譜[17-18]等技術(shù)，這些方法在各具優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，也存在著檢測(cè)通量不足、操作步驟繁瑣或者實(shí)驗(yàn)成本高昂等劣勢(shì)。但是，DNA質(zhì)譜技術(shù)因操作簡(jiǎn)便、成本低廉、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床和科研領(lǐng)域的SNP分型檢驗(yàn)中，并且美國(guó)Agena Bioscience公司還推出了可用于個(gè)人身份識(shí)別和樣本追蹤的iPLEX?Sample ID Plus Panel試劑盒。JOHANSEN等[17]的研究顯示，該試劑盒具有一定的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。然而，該試劑盒包含的45個(gè)常染色體SNP位點(diǎn)尚無(wú)法滿足我國(guó)法醫(yī)DNA鑒定標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)系統(tǒng)效能的要求[19]。為此，本研究特針對(duì)我國(guó)人群，結(jié)合實(shí)踐需求，篩選并建立了基于DNA質(zhì)譜技術(shù)的43重SNP復(fù)合檢驗(yàn)體系，并對(duì)其在華東地區(qū)漢族人群中的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用進(jìn)行評(píng)估，旨在與iPLEX?Sample ID Plus Panel試劑盒配合使用，為法醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本

本研究共收集了123例華東地區(qū)漢族健康無(wú)關(guān)個(gè)體的血液樣本，其中男性36例，女性87例。所有樣本的采集均遵循知情同意原則。

1.2 主要試劑及儀器

QIAamp?DNA Blood Mini試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司），Complete iPLEX?Pro Genetyping Reagent Set 10×96試劑盒（美國(guó)Agena Bioscience公司）。

9700型PCR儀（美國(guó)AB公司），MassARRAY?飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、MassARRAY?RS1000納升點(diǎn)樣儀（美國(guó)Agena Bioscience公司），旋轉(zhuǎn)混勻儀（杭州米歐儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取

按照QIAamp?DNA Blood Mini試劑盒說明書推薦流程提取每名志愿者200μL血液樣本中的DNA，并保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 位點(diǎn)選擇、優(yōu)化和復(fù)合擴(kuò)增體系設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)[1，6，7，20-22]報(bào)道和本實(shí)驗(yàn)室研究積累，選擇在中國(guó)漢族人群中最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）大于 0.2、符合 Hardy-Weinberg 平衡并且任意兩標(biāo)記間距離大于5 Mb的位點(diǎn)作為候選標(biāo)記。根據(jù)美國(guó)Agena Bioscience公司MassARRAY Typer 4.0軟件的設(shè)計(jì)結(jié)果，經(jīng)人工調(diào)整，獲得43個(gè)SNP位點(diǎn)的復(fù)合擴(kuò)增體系（表1）。引物組合比例及反應(yīng)體系均按照Complete iPLEX?Pro Genetyping Reagent Set 10×96試劑盒推薦比例配制。

表1 復(fù)合擴(kuò)增體系所包含的43個(gè)SNP位點(diǎn)及其染色體位置

1.3.3 PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增體系：10×緩沖液 0.5 μL、25 mmol/L MgCl20.4μL、25mmol/L dNTP 0.1μL、擴(kuò)增引物預(yù)混液 0.5μL、5U/μL擴(kuò)增酶0.1μL和DNA模板10ng，超純水補(bǔ)充至 5μL。

擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 2min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 60s，45個(gè)循環(huán)；72℃延伸 5min。

1.3.4 dNTP消化

反應(yīng)體系：在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP） 0.3 μL、SAP 緩沖液0.17μL和超純水1.53μL。

反應(yīng)條件：37℃孵育40min后，85℃熱失活SAP。

1.3.5 單堿基延伸

反應(yīng)體系：在消化反應(yīng)產(chǎn)物中加入10×Complete iPLEX?Pro Buffer Plus 0.2μL、Complete iPLEX?Pro Termination Mix 0.2μL、單堿基引物預(yù)混液 0.94μL、Complete iPLEX?Pro酶0.04μL和超純水0.62μL。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 30 s；95℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃ 5s，52℃ 5s，80℃ 5s，52℃ 5s，80℃ 5s，52℃5s，80℃ 5s，52℃ 5s，80℃ 5s，40 個(gè)循環(huán)；72℃延伸3min。

1.3.6 產(chǎn)物脫鹽

在單堿基延伸后的反應(yīng)產(chǎn)物中加入超純水41μL和預(yù)先風(fēng)干的潔凈樹脂15 mg，置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上孵育并溫和混勻15min，然后以4400×g離心5min。

1.3.7 芯片上樣

使用MassARRAY?RS1000納升點(diǎn)樣儀將脫鹽后的反應(yīng)產(chǎn)物上樣至Spectro CHIP Array 96點(diǎn)芯片上，通過調(diào)節(jié)點(diǎn)樣針與芯片的時(shí)間和點(diǎn)樣針的移動(dòng)速度使上樣體積在8～12μL范圍內(nèi)。

1.3.8 飛行時(shí)間質(zhì)譜檢驗(yàn)

使用MassARRAY?飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)上樣后的芯片進(jìn)行檢測(cè)，通過MassARRAY Typer 4.0軟件查看分型結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

個(gè)體識(shí)別率（DP）的計(jì)算公式：

式中，Pi為該群體第i個(gè)表型的頻率。

多態(tài)信息含量（PIC）的計(jì)算公式：

式中，n為等位基因數(shù)，Pi和Pj分別為第i個(gè)和第j個(gè)等位基因的頻率。

觀察雜合度（Ho）的計(jì)算公式：

預(yù)期雜合度（He）的計(jì)算公式：

式中，n為等位基因數(shù)，k為等位基因種類的數(shù)目，Pi為第i個(gè)等位基因的頻率。

三聯(lián)體非父排除率（PEtrio）的計(jì)算公式：

二聯(lián)體非父排除率（PEduo）的計(jì)算公式：

式中，n為等位基因數(shù)，Pi和Pj分別為第i個(gè)和第j個(gè)等位基因的頻率。

累積非父排除率（CPE）的計(jì)算公式：

式中，PEk為第k個(gè)遺傳標(biāo)記的PE值。

累積個(gè)體識(shí)別率（CDP）的計(jì)算公式：

式中，Pj為第j個(gè)等位基因的Pm值，∏Pj為第k個(gè)遺傳系統(tǒng)的總Pm值。

2 結(jié) 果

2.1 基因分型

本研究構(gòu)建了包含43個(gè)SNP位點(diǎn)的復(fù)合檢驗(yàn)體系。對(duì)123例樣本的分型結(jié)果顯示，除rs10776839位點(diǎn)的分型成功率不足65%以外，其余位點(diǎn)的分型成功率均超過97.56%。

2.2 等位基因頻率及其多樣性

43個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因頻率分布見表2。除rs1355366、rs2270529、rs10776839 和 rs938283 外，其余39個(gè)位點(diǎn)的MAF值均大于0.25，其中MAF值為0.4～0.5的高多態(tài)性位點(diǎn)有24個(gè)。此外，rs560681、rs7041158和rs914165 3個(gè)位點(diǎn)的MAF值也非常接近0.4。

2.3 法醫(yī)學(xué)評(píng)價(jià)

經(jīng)χ2檢驗(yàn)，123名華東地區(qū)漢族健康無(wú)關(guān)個(gè)體在43個(gè)SNP位點(diǎn)上均符合Hardy-Weinberg平衡（P〉0.05）。

43個(gè)SNP位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)參數(shù)見表3。其中DP 為 0.290 1～0.654 4，CDP 為 1-9.8×10-11，PIC 為0.1708～0.5000，Ho 為 0.1557～0.5935，PEtrio為 0.0854～0.2500，PEduo為 0.0146～0.1250。 各 SNP 位點(diǎn)之間相互獨(dú)立，采用乘積原則計(jì)算，CPEtrio為0.999 986，CPEduo為0.9924361。

表3 43個(gè)SNP位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)參數(shù) （n=123）

表3（續(xù)）

3 討 論

目前，雖然短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）遺傳標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外法醫(yī)物證學(xué)鑒定[23]中，但是其在實(shí)際應(yīng)用中存在明顯的缺陷。首先STR在遺傳過程中具有較高的突變率[24-25]，容易導(dǎo)致無(wú)法判斷親子關(guān)系或錯(cuò)誤判斷親子關(guān)系的情況。其次，對(duì)于高度降解檢材，基于毛細(xì)管電泳的STR檢驗(yàn)可能無(wú)法獲得全部基因座的完整分型結(jié)果，即使配合使用miniSTR試劑盒，也要求檢材DNA長(zhǎng)度在150 bp以上[26]。因此，針對(duì)STR遺傳標(biāo)記的不足，SNP遺傳標(biāo)記因其突變率低和檢驗(yàn)所需擴(kuò)增子短的特點(diǎn)，對(duì)于降解檢材和親子關(guān)系的檢測(cè)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，正成為法醫(yī)遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn)。雖然已經(jīng)有一些針對(duì)SNP遺傳標(biāo)記的檢驗(yàn)系統(tǒng)被開發(fā)出來(lái)，但是因檢測(cè)通量不足、操作步驟繁瑣或?qū)嶒?yàn)成本高昂等原因，不能滿足法醫(yī)物證學(xué)鑒定需要。DNA質(zhì)譜技術(shù)因操作簡(jiǎn)便、成本低廉、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于臨床和科研領(lǐng)域的SNP分型檢驗(yàn)之中，并且已經(jīng)有可用于個(gè)人身份識(shí)別和樣本追蹤的商品化試劑盒（iPLEX?Sample ID Plus Panel），因此本研究選擇了基于DNA質(zhì)譜技術(shù)平臺(tái)的SNP復(fù)合檢驗(yàn)系統(tǒng)，篩選并建立了43個(gè)SNP遺傳標(biāo)記復(fù)合檢驗(yàn)體系。復(fù)合擴(kuò)增遺傳標(biāo)記個(gè)數(shù)是決定檢驗(yàn)體系通量、成本和簡(jiǎn)便程度的直接指標(biāo)，本研究構(gòu)建了一個(gè)在同一反應(yīng)池內(nèi)包含43個(gè)SNP位點(diǎn)的復(fù)合檢驗(yàn)體系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除rs10776839外，其余位點(diǎn)的分型結(jié)果均穩(wěn)定可靠。與此前文獻(xiàn)[27-30]報(bào)道的SNP檢驗(yàn)系統(tǒng)相比，本系統(tǒng)的檢驗(yàn)通量明顯提高，雖不及高通量測(cè)序[16]，但是已能在相當(dāng)程度上滿足日常檢驗(yàn)需要。

本研究結(jié)果顯示，rs1355366、rs10776839和rs938283的MAF值在本次檢驗(yàn)的華東地區(qū)漢族人群中均小于0.2，我們將通過對(duì)更大人群樣本的研究對(duì)其進(jìn)行考察。為了提高本系統(tǒng)在實(shí)際檢案中的應(yīng)用能力，我們將對(duì)系統(tǒng)進(jìn)一步優(yōu)化，并考慮使用其他位點(diǎn)替換分型結(jié)果不穩(wěn)定的rs10776839及MAF值較低的rs1355366和rs938283，并增加性別檢驗(yàn)基因座。

43個(gè) SNP位點(diǎn)的 DP在 0.290 1（rs1355366）～0.654 4（rs9307465），其中 40 個(gè)位點(diǎn)的 DP 大于 0.5，24個(gè)位點(diǎn)的DP大于0.6，43個(gè)SNP復(fù)合檢驗(yàn)體系的CDP為1-9.8×10-11，表明其在華東漢族人群中具有較好的個(gè)體識(shí)別能力。

國(guó)際千人基因組計(jì)劃（http://www.international genome.org/）的數(shù)據(jù)顯示，iPLEX?Sample ID Plus Panel試劑盒所含45個(gè)常染色體SNP位點(diǎn)在我國(guó)北京漢族人群中MAF值介于0.4～0.5的高多態(tài)性位點(diǎn)僅有18個(gè)。本研究篩選并建立的43個(gè)SNP位點(diǎn)中MAF值為0.4～0.5的高多態(tài)性位點(diǎn)有24個(gè)。經(jīng)計(jì)算，iPLEX?Sample ID Plus Panel試劑盒所含45個(gè)常染色體SNP位點(diǎn)的CPEtrio和CPEduo分別為0.999 910 6和0.984 529 8。本研究篩選并建立的43個(gè)SNP復(fù)合檢驗(yàn)體系的CPEtrio和CPEduo分別為0.999 986和0.992 436 1，表明其在我國(guó)人群中具有良好的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。

我們?cè)谙到y(tǒng)設(shè)計(jì)過程中，特別考慮到與iPLEX?Sample ID Plus Panel試劑盒聯(lián)合使用，因此選擇了5個(gè)與iPLEX?Sample ID Plus Panel試劑盒重復(fù)的位點(diǎn)，分別為 rs876724、rs1463729、rs964681、rs901398和rs914165，作為聯(lián)合使用時(shí)的質(zhì)量控制位點(diǎn)，并在此基礎(chǔ)上選擇了38個(gè)符合乘積原則的高多態(tài)性獨(dú)立位點(diǎn)。因此，本體系可與iPLEX?Sample ID Plus Panel試劑盒聯(lián)合使用，其系統(tǒng)效能已經(jīng)達(dá)到或接近于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定的要求[19]。因此，本系統(tǒng)可以用于個(gè)體識(shí)別或三聯(lián)體親子關(guān)系鑒定，也可用作對(duì)STR標(biāo)記系統(tǒng)的補(bǔ)充和驗(yàn)證，特別是對(duì)于特殊情況下的高度降解檢材和出現(xiàn)不符合遺傳學(xué)規(guī)律的親子鑒定。

本研究針對(duì)我國(guó)人群建立了基于DNA質(zhì)譜技術(shù)的43重SNP復(fù)合檢驗(yàn)體系，并對(duì)其在華東地區(qū)漢族人群中的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用進(jìn)行了評(píng)估。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該系統(tǒng)具有較高的遺傳多態(tài)性，既可以作為傳統(tǒng)STR遺傳標(biāo)記的有效補(bǔ)充和驗(yàn)證，也可以與其他商品化試劑盒配合使用，以應(yīng)對(duì)高降解檢材和出現(xiàn)不符合遺傳規(guī)律現(xiàn)象親子鑒定的挑戰(zhàn)。本課題組將在今后的工作中繼續(xù)對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化并對(duì)體系極端適用條件進(jìn)行測(cè)試，以期獲得可用于法醫(yī)物證鑒定實(shí)踐的SNP檢測(cè)系統(tǒng)。

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