，，， (延安大學咸陽醫(yī)院病理科，陜西 咸陽 712000)

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌異常的惡性腫瘤，占女性所有類型惡性腫瘤的5%左右，在中國，每年約有20 000的惡性甲狀腺癌患者死亡[1-2]。甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是甲狀腺惡性腫瘤中最常見的腫瘤類型，約占80%[3]。針對甲狀腺乳頭狀癌的治療目前主要采取手術聯(lián)合放療，但是治愈率不高[4]。探討新型腫瘤分子標記物是目前急需解決的問題。

目前研究指出參與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)展的最常見的遺傳改變包括RET-RAS-BRAF基因激、RET基因重排、BRAFV600E點突變及RAS突變等[5]。雖然這些遺傳改變會導致相同的信號通路的激活，但針對其具體機制作用的發(fā)揮目前不甚清楚。在人類基因組中，每個miRNA可以控制多個基因靶標，并且可以通過翻譯抑制調(diào)控相應蛋白的表達。關于基因表達模式的調(diào)節(jié)，miRNA類似于直接調(diào)節(jié)靶基因表達的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子及其直接靶向于分子通路，負責特定的生物學現(xiàn)象。關于如何在甲狀腺癌中轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)miRNA的信息有限[6]，有研究通過結(jié)合核小體染色質(zhì)標記以及DNA序列鑒定了175個miRNA的啟動子區(qū)域，用于預測調(diào)控miRNA的轉(zhuǎn)錄因子，探討miRNA在不同惡性腫瘤類型中的候選轉(zhuǎn)錄起始位點及生物學表達模式[7-8]。圓柱菌酶(cylindromatosis，CYLD)是卵巢腫瘤家族中的一種泛素-羧基末端水解酶，其由分解各種細胞蛋白質(zhì)中的賴氨酸酶連接多聚蛋白鏈組成[9]。CYLD在多種組織中均有表達，但其精確的生物學功能仍然不確定[10]。體外轉(zhuǎn)染研究結(jié)果表明，CYLD通過蛋白水解酶來降低NF-κB活性干擾腫瘤細胞的生長[11]。但CYLD和miRNA之間的直接作用缺乏研究證據(jù)。

本實驗通過研究miR-181b和CYLD在甲狀腺乳頭狀癌中的表達情況及相互作用，抑制miR-181b表達后甲狀腺癌細胞株的增殖和凋亡行為的變化情況來推測miR-181b在甲狀腺癌中的表達模式，明確其對甲狀腺乳頭狀癌細胞的調(diào)控作用，為甲狀腺癌乳頭狀癌的發(fā)病機制和發(fā)展過程的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞株及實驗材料

收集2016年7月至2017年1月在我院手術切除并且經(jīng)病理檢查確診為甲狀腺癌患者30例的病變組織，同時取30例癌旁正常人的組織。離體后放入4%多聚甲醛中固定。人甲狀腺乳頭狀癌細胞株FTC-133、IHH-4、TPC-1和K1細胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。miR-181b-inhibitor和陰性對照(NC)購自中國上海GenePharma生物有限公司。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、miR-181b-inhibitor和NC組模擬物購自上海吉凱基因，TRIrizol購自美國Ambion公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(FSQ-101)購自日本TOYOBO公司，PCR試劑盒購自美國Kapa公司。

1.2 定量實時PCR分析

將細胞接種在12孔板中，生長至50%融合以進行siRNA轉(zhuǎn)染，90%用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。根據(jù)制造商的方案，使用Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和siRNA。在轉(zhuǎn)染后第3天，收獲細胞，并使用TRIZOL試劑提取總RNA。使用ImProm-II TM逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)對總RNA水平進行qPCR分析。所有反應用Step-One Plus實時PCR系統(tǒng)進行，實驗重復3次。

1.3 蛋白質(zhì)印跡測定

使用RIPA緩沖液提取總細胞裂解物，通過配置12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉，并在4 ℃下與一抗(濃度1∶1 000)一起孵育過夜。隨后，將膜與二抗孵育，最后用ECL底物試劑盒檢測，實驗重復3次。

1.4 細胞克隆形成實驗

將NC組細胞和miR-181b-inhibitor組細胞分別以2×103濃度接種在6孔板中，在37 ℃孵箱孵育2周，每3 d更換新鮮培養(yǎng)基，2周后在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，計數(shù)細胞克隆形成數(shù)目，對比2組之間的差異，實驗重復3次。

1.5 流式細胞儀分析

流式細胞術檢測甲狀腺乳頭狀癌細胞凋亡情況。將FTC-133細胞以2×105/孔的濃度接種在6孔板中，分別用NC和miR-181b-inhibitor轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72 h后，通過FITC標記的AnnexinV/碘化丙啶細胞凋亡檢測試劑盒檢測凋亡細胞，實驗重復3次。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 miR-181b在甲狀腺乳頭狀癌組織和細胞中的表達情況

qPCR結(jié)果表明：與癌旁正常組織相比(圖1)，甲狀腺乳頭狀癌組織中miR-181b表達水平明顯較高[(2.21±0.31)vs.(0.62±0.17)]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；miR-181b在FTC-133胞株中表達水平比IHH-4、K1、TPC-1細胞株明顯增高[(1.86±0.18)vs.(0.89±0.11)vs.(0.86±0.14)vs.(1.07±0.11),P<0.05](圖1)。綜合上述試驗結(jié)果，挑選FTC-133為進一步生物學功能實驗的細胞株。

a:miR-181b在甲狀腺乳頭狀癌組織和正常組織中的表達；b:miR-181b在不同甲狀腺乳頭狀癌細胞株中的表達

圖1miR-181b的表達情況

2.2 miR-181b與CYLD之間的調(diào)控關系

通過Western blotting檢測miR-181b調(diào)控CYLD的表達水平。結(jié)果顯示，在miR-181b-ibhibitor組中CYLD的表達水平比NC組的明顯降低[(0.55±0.11)vs.(2.39±0.32)，P<0.05]，見圖2，表明抑制miR-181b的表達后，CYLD蛋白的激活水平相應下調(diào)。

2.3 miR-181b調(diào)控甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖行為

細胞克隆形成實驗結(jié)果顯示(圖3)，miR-181b-inhibitor實驗組的細胞克隆形成數(shù)目明顯低于NC對照組[(351.2±25.6)vs.(112.6±18.6)]，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明抑制miR-181b的表達后，甲狀腺乳頭狀細胞FTC-133的增殖能力受到一定的抑制。

a:Western blotting檢查CYLD;b:Western blotting結(jié)果定量分析

圖2Westernblotting檢測miR-181b對CYLD蛋白表達的調(diào)控

a:對照組;b:miR-181b組;c:2組細胞數(shù)量定量分析

圖3克隆形成實驗檢測miR-181b對甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖能力的影響

2.4 miR-181b調(diào)控甲狀腺乳頭狀癌的凋亡行為

細胞凋亡實驗顯示，miR-181b-inhibitor實驗組的細胞凋亡比率明顯高于NC對照組[(2.28±0.27)vs.(0.75±0.18)，P<0.05]，差異具有統(tǒng)計學意義，表明抑制miR-181b的表達后，甲狀腺乳頭狀癌細胞的凋亡行為得到一定程度的促進。

a:對照組；b:miR-181b組

圖4流式細胞術檢測miR-181b對甲狀腺乳頭狀癌細胞凋亡行為的影響

3 討論

在不同甲狀腺腫瘤的組織病理學類型具有不同的miRNA差異譜，反映了在miRNA在腫瘤中的特異性致癌突變[12]。從其發(fā)現(xiàn)的早期階段，已經(jīng)知道許多miRNA以組織特異性方式表達[13]。因此，研究miRNA在甲狀腺腫瘤之間的表達模式有重要的臨床意義。在甲狀腺乳頭狀癌中經(jīng)常觀察到miR-181b的表達異?，F(xiàn)象[14]。然而迄今為止，miR-181b和甲狀腺乳頭狀癌之間的關系尚未完全了解。本研究結(jié)果表明miR-181b在腫瘤性甲狀腺乳頭狀細胞中具有一定的致癌作用，作為CYLD蛋白的調(diào)節(jié)因子參與甲狀腺癌細胞的增殖和凋亡過程。事實上，據(jù)其他學者的相關報道指出，miR-181b在其他腫瘤中也可觀察到明顯的上調(diào)狀態(tài)，包括膠質(zhì)瘤細胞系，前列腺癌細胞系和轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞系[15-17]。miR-181b可能有一定的腫瘤組織特異性和依賴性，其與基因表達調(diào)控的復雜網(wǎng)絡相關聯(lián)，在不同類型的惡性腫瘤中可以靶向不同的下游蛋白種類[18]。類似地，CYLD蛋白在惡性腫瘤中具有相似的作用，在上皮衍生的腫瘤中作為調(diào)控因子發(fā)揮作用，并且可作為間質(zhì)源性腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的腫瘤啟動子因子[19]。因此，miR-181b對CYLD蛋白的調(diào)控可能是甲狀腺乳頭狀癌中獨特的表達模式。

惡性腫瘤細胞的增殖潛力取決于調(diào)控因子對細胞周期阻滯的能力。miR-181b與甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖能力密切相關，而且可以通過調(diào)控CYLD的表達介導FTC-133細胞的細胞周期停滯，表明miR-181b具備一定的促細胞增殖的能力。miRNA分析的結(jié)果提供了更多的證據(jù)來支持腫瘤細胞具有獨特的上調(diào)miRNA并且與常規(guī)腫瘤類型不同，尤其是腺瘤和癌之間的表達差異。根據(jù)之前的相關研究，指出miRNA表達譜在特定腫瘤類型中具有顯著的變異性[20]。本實驗的研究數(shù)據(jù)表明，在這三種miRNA中，miR-181b在所有類型的濾泡細胞衍生的甲狀腺腫瘤中以及甲狀腺增生性結(jié)節(jié)中都存在過表達狀態(tài)，且和甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖和凋亡行為直接相關。

總體而言，本實驗觀察到甲狀腺乳頭狀癌的腫瘤類型和miR-181b表達之間的具有顯著相關性，與甲狀腺乳頭狀癌的表型特征及生物學特性相關。且miR-181b的表達和CYLD的表達之間的具體調(diào)控機制尚不清楚，但miR-181b的確可以影響甲狀腺乳頭狀癌的生長和增殖，可能被用作臨床甲狀腺乳頭狀癌的治療和預后標志物。

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