，， ， ，， ， ，， [陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))第一附屬醫(yī)院兒科，重慶 400038]

支氣管哮喘(哮喘)是一種影響到全球所有年齡組的嚴(yán)重疾病[1]，其以氣道高反應(yīng)性為主要表現(xiàn)的變態(tài)反應(yīng)性疾病，可能存在Th2細(xì)胞活化亢進(jìn)的免疫學(xué)異常、輔助性T細(xì)胞(Th)亞群功能失衡，近年發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)在支氣管哮喘的發(fā)病中也占重要地位。哮喘特異性免疫治療(allergen-SIT)是目前唯一針對(duì)其病因的有效的預(yù)防、治療手段[2]，SIT治療是可以改變過(guò)敏性疾病病程的主要方法之一[3]。目前認(rèn)為，SIT哮喘治療的主要機(jī)制可能是誘導(dǎo)機(jī)體外周抗原特異性免疫耐受的形成[4]。Th17細(xì)胞在哮喘的呼吸道炎癥中發(fā)揮著極其重要作用，IL-23在Th17細(xì)胞增殖和穩(wěn)定中起著重要作用，有研究已證實(shí)IL-23/Th17軸在支氣管哮喘的發(fā)病中起著重要作用[5-7]。由此我們推測(cè)，在SIT治療免疫應(yīng)答過(guò)程中，DC攝取抗原并提呈信號(hào)給T淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致IL-23/Th17軸變化參與了SIT免疫治療的過(guò)程，而且這一過(guò)程與SIT治療效率相關(guān)，由于口服耐受與皮下特異性免疫治療(SCIT)的免疫應(yīng)答場(chǎng)所、應(yīng)答細(xì)胞及免疫應(yīng)答過(guò)程均可能不同，而SCIT是目前臨床上應(yīng)用最廣泛，最主要的免疫療法[8-9]。為進(jìn)一步研究SIT的機(jī)制，我們建立大劑量卵白蛋白(ovalbumin,OVA)皮下注射建立SCIT治療哮喘模型，通過(guò)檢測(cè)氣道高反應(yīng)性(AHR)、氣道炎癥及血清IgE水平等情況，證實(shí)建立免疫治療模型成功，并發(fā)現(xiàn)在免疫治療組中，Treg細(xì)胞比例明顯增高，IL-23表達(dá)水平降低，而Th17細(xì)胞比例明顯降低，這為通過(guò)調(diào)控IL-23/Th17細(xì)胞途徑的分化來(lái)增強(qiáng)SIT治療效果提供了新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 18只清潔級(jí)BALB/c雌性小鼠，6～8周齡，質(zhì)量16～20 g，由北京華阜康生物科技有限公司提供，采用隨機(jī)數(shù)字法分成3組：哮喘免疫治療組、哮喘對(duì)照組、空白對(duì)照組3組，每組6只。

1.1.2 主要試劑及設(shè)備 由美國(guó)Sigma公司提供雞卵白蛋白；Mouse Th2 Cell Multi-Color Flow Cytometry Kit、氫氧化鋁[Al(OH)3]由美國(guó)R&D公司Catalog Number：FMC012提供；Flow XTM Mouse Regulatory TCell Multi-Color Flow Cytometry Kit由美國(guó)R&D公司Catalog Number：FMC022；德國(guó)百瑞 Pari-Master霧化器，可以霧化顆粒直徑大小為0.5～0.5 μm；美國(guó)寶特公司的標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)儀；德林診斷產(chǎn)品有限公司的自動(dòng)平衡離心機(jī)；日本Olympus公司的光學(xué)顯微鏡；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BectonDickinson公司。

1.2 方法

1.2.1 建立哮喘小鼠免疫治療模型 哮喘小鼠免疫模型建立按文獻(xiàn)[10]進(jìn)行(圖1)。哮喘免疫治療組在0、7 d予溶于100 μL無(wú)菌生理鹽水的OVA 10 μg+Al(OH)32.25 mg混合液，予腹腔注射致敏BALB/c小鼠，予大劑量OVA(V級(jí))皮下注射[含1 mg OVA+Al(OH)32 mg的生理鹽水200 μL]21～27 d持續(xù)7 d(注：預(yù)實(shí)驗(yàn)中小鼠對(duì)1 mg OVA可完全耐受，無(wú)嚴(yán)重或致死性過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生，故用1 mg OVA行皮下免疫治療)；在35～41 d采用1% OVA霧化激發(fā)。10% OVA在50 d加強(qiáng)激發(fā)1次。在0、7 d予哮喘對(duì)照組OVA 10 μg+Al(OH)32.25 mg溶于100 μL無(wú)菌性生理鹽水混合液，采取腹腔注射致敏BALB/c小鼠，21～27 d給予等量生理鹽水皮下注射，35～41 d予1% OVA霧化激發(fā)，50 d予10% OVA加強(qiáng)激發(fā)1次?？瞻讓?duì)照組予等量生理鹽水和生理鹽水霧化激發(fā)、加強(qiáng)激發(fā)。所有動(dòng)物在末次激發(fā)后觀察活體反應(yīng)及氣道反應(yīng)性24 h后并于50 d處死、解剖。

1.2.2 檢測(cè)氣道反應(yīng)性 末次激發(fā)各組小鼠后檢測(cè)24 h內(nèi)氣道反應(yīng)性，檢測(cè)小鼠自主呼吸在小鼠清醒狀態(tài)下采取體積描述法，然后待檢測(cè)的小鼠以倍增質(zhì)量濃度(3.125、12.5、50 ng/mL)的乙酰膽堿(Ach)霧化3 min，然后休息2 min，連續(xù)記錄讀數(shù)5 min并取各組數(shù)據(jù)平均值，氣道高反應(yīng)性水平均以相應(yīng)Ach濃度激發(fā)下的增強(qiáng)呼吸間歇(enhanced pause，Penh)值來(lái)反映，Penh：PEP/PIP×pause。

1.2.3 BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)及肺部組織學(xué)分析 末次激發(fā)各組小鼠24 h后，麻醉采用腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉，摘除各組小鼠眼球放血收集血清，保存在-80 ℃待檢。采取頸椎脫位處死，然后暴露頸部，插入靜脈留置針并分離各小鼠氣管，注入1 mL PBS至灌洗區(qū)，然后反復(fù)灌洗5次后，抽吸各組小鼠的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)逐一注入離心管中計(jì)量(回吸率在80%為合格)，4 ℃、1 500 r/min離心10 min后，收集好上清液保存到-80 ℃?zhèn)溆?。沉淀?xì)胞重懸后用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。剩余細(xì)胞涂片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行各種細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。將處死的小鼠開(kāi)胸取出肺組織盛入4%多聚甲醛瓶中固定，酒精脫水，石蠟包埋、切片，HE染色，采用顯微鏡觀察小鼠肺組織中的支氣管及其細(xì)支氣管的周圍炎癥、支氣管血管周圍的炎癥、肺泡周圍組織炎癥的病理特點(diǎn)。

圖1 哮喘免疫治療模型的建立

1.2.4 ELISA 血清OVA特異性IgE檢測(cè)；BALF中IL-5、IFN-γ、IL-10檢測(cè)(檢測(cè)參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)。

1.2.5 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)脾、肺組織Treg、Th17細(xì)胞比例 根據(jù)文獻(xiàn)[11]，無(wú)菌取小鼠脾，搗碎，于40 μm金屬網(wǎng)過(guò)濾，收集細(xì)胞用冷RPMI-1640洗滌細(xì)胞2次，加入紅細(xì)胞裂解液，離心500 g 2 min，去上清液，用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液混勻，在37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)滿12 h后，離心去除上清，加入含10%FBS的RPMI-1640 培養(yǎng)液后，按使用說(shuō)明加入FITC標(biāo)記的抗小鼠CD4抗體，然后固定、加入打孔劑，分別加入Foxp3-PE和RORγt-PE的抗體，隨后用FACS檢測(cè)。取用于觀察肺組織學(xué)檢測(cè)的剩余肺葉組織，機(jī)械搗碎，用3 mgU/mL膠原酶(collagenase D)37 ℃，消化2 h，將消化的肺組織用RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，用70 μm尼龍篩過(guò)濾細(xì)胞后用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，37 ℃、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)滿12 h后，離心后去上清液，先后加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液及FITC標(biāo)記后的抗小鼠CD4抗體，然后固定、加入打孔劑，分別加入PE標(biāo)記抗鼠Foxp3抗體及PE標(biāo)記的抗鼠IL-17抗體，之后用FACS檢測(cè)。用PBMC 1×106個(gè)，2 mL Flow Cytometry Staining Buffer洗細(xì)胞1次，在blocking IgG避光4 ℃孵育10 min后阻斷細(xì)胞，各管細(xì)胞中加入10 μL CD4-FITC、10 μL CD25-APC antibodies或同型對(duì)照的對(duì)應(yīng)的避光4 ℃孵育30 min。采用預(yù)冷的1×PBS洗滌細(xì)胞2次，在1×FoxP3 Fixation Buffer細(xì)胞重懸4 ℃孵育30 min。采用預(yù)冷的1×FoxP3 Permeabilization and Wash Buffer洗滌細(xì)胞2次，然后各管細(xì)胞加入10 μL FoxP3 antibody或rabbit IgG-PE isotype 4 ℃孵育30 min。用預(yù)冷的1×FoxP3 Permeabilization and wash Buffer反復(fù)洗滌細(xì)胞2次，最后予流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 q-PCR檢測(cè)肺組織轉(zhuǎn)錄因子 用q-PCR技術(shù)檢測(cè)剩余肺組織中Foxp3、RORγt表達(dá)水平。采用RNAzol試劑Trizol法提取肺組織總RNA，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄使用using oligo (dT18)引物，q-PCR用Quanti Fast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN，Germany)、ABI Step One Plus System (Applied Biosystems，USA)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；95 ℃變性5 s，65 ℃延伸60 s，97 ℃酶瞬間滅活；40 ℃冷卻10 s。數(shù)據(jù)用2-△△Ct法分析基因表達(dá)相對(duì)定量，使用β-actin作為內(nèi)參照，最后用基因表達(dá)與內(nèi)參照的比值表示。引物序列如下：Foxp3 5’-GGCCCTTCTCCAGGACAGA-3’；5’-GGCATGGGCATCCACAGT-3’ RORγt 5’-TGCGACTGGAGGACCTTCTA-3’；5’-TCACCTCCTCCCGTGAAAAG-3’ β-actin 5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’；5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大劑量OVA SCIT免疫治療抑制致敏哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性

在50 d末次激發(fā)后24 h內(nèi)檢測(cè)呼吸道反應(yīng)性，先于清醒狀態(tài)測(cè)定各組小鼠基礎(chǔ)Penh值，隨之采用不同Ach濃度激發(fā)，分別記錄在質(zhì)量濃度為3.125、12.5、25 ng/mL時(shí)對(duì)應(yīng)的Penh值，然后霧化3 min，休息2 min，連續(xù)記錄5 min，將所得各組數(shù)值取其平均值。各組實(shí)驗(yàn)小鼠隨吸入Ach濃度的逐漸增加，各自的氣道反應(yīng)性也逐漸增高，但是各組氣道反應(yīng)性增加的幅度比不相同，Ach的濃度從3.125 ng/mL開(kāi)始升至25 ng/mL，哮喘對(duì)照組較哮喘免疫治療組的氣道反應(yīng)性明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

*:與其他兩組比較，P<0.05

圖2各組小鼠吸入不同濃度乙酰膽堿時(shí)呼吸道反應(yīng)性的變化

2.2 大劑量皮下OVA SCIT哮喘免疫治療減輕氣道炎癥反應(yīng)

大劑量OVA SCIT免疫治療降低BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)。50 d收集各組實(shí)驗(yàn)小鼠的BALF，離心，重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及HE染色計(jì)數(shù)細(xì)胞分類數(shù)量。與哮喘對(duì)照組比較，空白對(duì)照組細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；免疫治療組中BALF的細(xì)胞總數(shù)，嗜酸性細(xì)胞(EC)及淋巴細(xì)胞(LC)較哮喘對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)較哮喘對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1各組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)及炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)(n=6，×106ng/mL)

組別 細(xì)胞總數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞中性粒細(xì)胞空白對(duì)照組75.83±8.21?26.00±5.22?35.67±4.41?5.67±1.97?哮喘對(duì)照組207.33±15.6369.17±11.02106.17±7.3132.33±3.61免疫治療組128.17±11.48?40.00±3.90?55.67±5.24?11.50±1.87?

*:與哮喘對(duì)照組比較，P<0.05

大劑量皮下OVA免疫治療減輕肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。相比空白對(duì)照組，哮喘小鼠組見(jiàn)肺組織各支氣管下，血管周圍明顯出現(xiàn)炎癥改變，肺泡管腔內(nèi)及肺間質(zhì)可見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞，支氣管的管腔內(nèi)可見(jiàn)較多黏液栓，可見(jiàn)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管壁水腫充血，上皮細(xì)胞明顯脫落壞死；哮喘小鼠免疫治療組較哮喘對(duì)照組的炎癥反應(yīng)明顯減輕(圖3)。結(jié)果表明，SIT治療針對(duì)輕中度哮喘早期治療，可以避免朝重度哮喘發(fā)展。并且可減輕氣道重塑。

a：空白對(duì)照組；b：哮喘對(duì)照組；c：免疫治療組

2.3 大劑量OVA SCIT免疫治療降低血清OVA特異性IgE及調(diào)節(jié)BALF炎癥因子分泌

50 d處死各組小鼠，取每組小鼠BALF及外周血標(biāo)本，進(jìn)行檢測(cè)BALF中IL-5、IFN-γ、IL-10及血清OVA特異性IgE濃度(按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行)。結(jié)果顯示，空白對(duì)照組與哮喘對(duì)照組相比較，BALF中的IL-10濃度升高，而IL-5濃度降低，血清OVA特異性IgE濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；哮喘對(duì)照組與哮喘免疫治療組比較：BALF中IL-10濃度降低，而IL-17A、IL-5、IL-6及血清OVA特異性IgE濃度均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。INF-γ在哮喘對(duì)照組與哮喘免疫治療組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。本研究發(fā)現(xiàn)IL-10、IL-17A均有改變，說(shuō)明Treg、Th17參與SIT免疫機(jī)制。

表2各組小鼠BALF中細(xì)胞因子及血清OVA特異性IgE濃度(n=6)

組別空白對(duì)照組哮喘對(duì)照組免疫治療組IL-5(pg/mL)19.23±3.27?516.28±21.1874.71±6.13?INF-γ(pg/mL)98.55±17.63?202.33±12.66180.73±28.98?IL-10(pg/mL)155.17±8.75?80.67±34.55230.50±9.44?IgE(×103ng/mL)156.72±11.14?711.16±33.95422.00±6.60?IL-17A(pg/mL)20.37±4.02?95.10±2.9035.02±5.00?IL-6(pg/mL)8.92±1.80?39.62±2.8617.89±1.88?IL-23(pg/mL)1.920±0.202.868±0.122.618±0.12

*:與哮喘對(duì)照組比較，P<0.05

2.4 大劑量OVA SCIT免疫治療改變肺組織及脾Th17及Treg 細(xì)胞比例

50 d處死小鼠后，取出各組小鼠脾組織及肺組織進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg占Th17細(xì)胞的百分率，檢測(cè)結(jié)果示哮喘免疫治療組Treg/Th17細(xì)胞百分率明顯高于哮喘對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

2.5 免疫治療大劑量OVA調(diào)節(jié)肺組織Th17和Treg轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)

50 d處死小鼠，取各組小鼠剩余肺組織標(biāo)本q-PCR檢測(cè)Foxp3、RORγt表達(dá)水平。結(jié)果表明，在Th17及Treg細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子水平發(fā)現(xiàn)，免疫治療組肺組織CD4+RORγt+T細(xì)胞及CD4+Foxp3+T細(xì)胞與哮喘對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3q-PCR檢測(cè)各組小鼠肺組織Th17和Treg轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)(n=6)

組別 mRNA Foxp3+/β-actinmRNA RORγt+/β-actin空白對(duì)照組5.95±0.23?0.46±0.04?哮喘對(duì)照組2.18±0.073.06±0.09免疫治療組3.18±0.08?1.75±0.14?

*:與哮喘對(duì)照組比較，P<0.05

2.6 相關(guān)性分析

血清IL-23和脾的Th17細(xì)胞百分率呈正相關(guān)(n=18，r=0.908，P<0.05);血清IL-23和肺Th17細(xì)胞百分率呈正相關(guān)(n=18，r=0.922，P<0.05)。大劑量OVA免疫治療引起的Th17細(xì)胞下降伴隨IL-23表達(dá)的降低。這與在支氣管哮喘的免疫發(fā)病機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)其中IL-23/Th17軸起重要作用的相關(guān)研究相一致。已有臨床研究證實(shí)，收集到的支氣管哮喘患者的肺泡灌洗液、痰液或血清液中，Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子均明顯升高，以及Th17細(xì)胞的數(shù)量及IL-17A的表達(dá)水平與呼吸道高反應(yīng)性及疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[12]。

a:脾流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果;b:脾Treg和Th17細(xì)胞數(shù);c:脾Treg/Th17比值;d:肺流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果;e:肺Treg和Th17細(xì)胞數(shù);f:肺Treg/Th17比值 *：與哮喘對(duì)照組Treg細(xì)胞數(shù)比較，P<0.05；#：與哮喘組Th17細(xì)胞數(shù)比較，P<0.05

圖4流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組小鼠肺及脾組織Treg及Th17細(xì)胞比例

3 討論

支氣管哮喘是輔助性T細(xì)胞(T helper cell，Th cell)調(diào)節(jié)的氣道慢性炎癥性疾病，Th1/Th2的失衡曾被認(rèn)為是哮喘的發(fā)病機(jī)制。目前認(rèn)為，除Th1/Th2的失衡外，其他的免疫學(xué)原理在解釋控制哮喘及過(guò)敏的發(fā)病中具有非常重要的價(jià)值，其中通過(guò)外周抗原誘導(dǎo)機(jī)體特異性免疫耐受形成的機(jī)制，這個(gè)免疫機(jī)制可能是支氣管哮喘特異性SIT免疫治療的比較重要機(jī)制之一，但至今其機(jī)理未完全闡明。

其中CD4+調(diào)節(jié)性T(Th)細(xì)胞在哮喘中扮演著重要的角色，Th17細(xì)胞是新近在CD4+T(Th)細(xì)胞中的一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的亞群，Th17細(xì)胞主要分泌IL-17A，通過(guò)刺激氣道上皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體釋放各種炎癥介質(zhì)參與支氣管哮喘氣道炎癥反應(yīng)[12-14]。臨床研究中發(fā)現(xiàn)，收集到的支氣管哮喘患者的外周血液中的單核細(xì)胞內(nèi)，Th17細(xì)胞及其受體CCR6數(shù)量均有明顯升高，IL-23通過(guò)作用于這些激活狀態(tài)的Th17細(xì)胞從而促使支氣管哮喘患者癥狀加重[15]。已證實(shí)，Th17細(xì)胞參與介導(dǎo)氣道中性粒細(xì)胞炎癥過(guò)程并與哮喘嚴(yán)重程度相關(guān)，此外也與哮喘的嗜酸性粒細(xì)胞密切相關(guān)[16-17]。在氣道炎癥模型中已得到證實(shí)，IL-17皮下注射可使口服致耐受治療緩解的氣道炎癥加重[18]。

IL-23是IL-12細(xì)胞因子家族的一個(gè)新成員，IL-23不參加初始T淋巴細(xì)胞的分化，是Th17 細(xì)胞增殖和功能穩(wěn)定的重要因子[19]，IL-23主要通過(guò)參與Thl7細(xì)胞分泌IL-17A和IL-17F的過(guò)程而導(dǎo)致氣道炎癥加重[20]。IL-23的主要在Th17細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)及擴(kuò)增上起作用，同時(shí)主要參與到Th17細(xì)胞的中性粒細(xì)胞性氣道的炎癥，同時(shí)可促進(jìn)以Th2細(xì)胞為主的嗜酸性粒細(xì)胞呼吸道炎癥[21]。有研究指出，支氣管哮喘患者體內(nèi)的IL-23對(duì)Th17細(xì)胞的活化以及記憶性Th17細(xì)胞的產(chǎn)生起到極其關(guān)鍵作用[22-23]，據(jù)此有學(xué)者推測(cè)在支氣管哮喘和重度支氣管哮喘(severe bronchial asthma，SBA)中Thl7細(xì)胞的活化以及IL-23/Th17軸參與了疾病的發(fā)生和發(fā)展。

本研究中哮喘小鼠血清中IL-23 、IL-17A濃度均高于哮喘小鼠免疫治療組，這與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果基本相一致。另外有研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者血清中IL-23水平升高，故哮喘免疫治療可能是通過(guò)抑制IL-23/Th17 軸及Th17細(xì)胞活化而達(dá)到控制支氣管哮喘。近年來(lái)，大量臨床資料表明，哮喘特異性免疫治療的主要機(jī)制很有可能是通過(guò)有效降低哮喘患者的呼吸道的反應(yīng)性，從而逐漸減少相關(guān)治療藥物的劑量[9]。目前經(jīng)氣道霧化吸入糖皮質(zhì)激素是支氣管哮喘的主要治療方式，但吸入激素目前不能完全治愈某些重度支氣管哮喘，只是部分控制哮喘的癥狀。目前認(rèn)為，哮喘的免疫治療是針對(duì)哮喘的病因治療之一，哮喘免疫治療模型國(guó)內(nèi)外均有相應(yīng)報(bào)道，我們根據(jù)不同的哮喘小鼠的免疫功能狀態(tài)，本研究以通過(guò)大劑量OVA皮下注射建立了哮喘小鼠免疫治療模型，得出了哮喘小鼠免疫治療是IL-23/Th17軸和Th17細(xì)胞的受到抑制的結(jié)果。本研究結(jié)果顯示：小鼠哮喘免疫治療組大劑量予皮下注射OVA后，哮喘小鼠的呼吸道的反應(yīng)性、BALF中的嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、IL-23、IL-17水平及血清OVA特異性IgE水平明顯低于哮喘對(duì)照組，Th2細(xì)胞因子IL-5百分比明顯低于哮喘組；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)外周血Treg/Th17細(xì)胞百分比明顯高于哮喘對(duì)照組，說(shuō)明IL-23、Th17、Treg細(xì)胞參與SIT免疫機(jī)制，通過(guò)對(duì)肺、脾解剖，發(fā)現(xiàn)肺組織及脾組織發(fā)現(xiàn)CD4+FOXP3+Treg及Th17細(xì)胞有差異，且脾及肺的Th17細(xì)胞都與血清IL-23呈正相關(guān)，其哮喘免疫治療作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制IL-23/Th17細(xì)胞途徑而發(fā)揮作用。在本研究中哮喘小鼠的血清中IL-23、IL-17A的濃度均高于免疫治療組，這與國(guó)內(nèi)外結(jié)果研究基本一致。Li等[21]在OVA哮喘免疫治療中發(fā)現(xiàn)，沉默的IL-23基因以降低哮喘患者IL-17A進(jìn)而減輕呼吸道的炎癥。與目前的一些臨床研究發(fā)現(xiàn)一致，支氣管哮喘患者的IL-23血清水平是明顯升高的[24-25]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究顯示腹部皮下大劑量OVA注射建立了哮喘小鼠免疫治療模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD4+FOXP3+Treg及IL-10、IL-23，IL-17A參與哮喘小鼠免疫耐受的形成。但目前對(duì)CD4+T細(xì)胞亞群與IL-23/Th17軸間的調(diào)節(jié)機(jī)制，Th2細(xì)胞與IL-23/Th17軸在由變應(yīng)原誘導(dǎo)的慢性炎癥中起主導(dǎo)作用的是哪一種細(xì)胞，Th2 細(xì)胞免疫反應(yīng)由IL-23如何調(diào)節(jié)、IL-23 能否直接作用于Thl細(xì)胞免疫反應(yīng)從而調(diào)控哮喘等[26]，隨著哮喘的免疫治療進(jìn)一步深入研究，在哮喘的作用機(jī)制中，IL-23/Th17軸的研究可能會(huì)為研究支氣管哮喘的病因及免疫治療提供新的靶點(diǎn)及方法。

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