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(南華大學(xué)藥物藥理研究所血管生物學(xué)實驗室，湖南 衡陽 421001)

動脈平滑肌細(xì)胞(ASMC)在不同的動脈或相同血管床的不同部位以及血管壁的不同層次等存在表型異質(zhì)性。細(xì)胞表型異質(zhì)性表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)學(xué)表型差異、平滑肌細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)差別和不同的生長能力。與骨骼肌和心肌細(xì)胞不同，ASMC在分化終末時仍保持高度的可塑性，并能從收縮表型向增殖、分泌的表型轉(zhuǎn)變[1]，而后者主要導(dǎo)致血管增長和重構(gòu)，是血管適應(yīng)動脈粥樣硬化、高血壓時病理生理刺激的基本要素[2]。當(dāng)血管生長在原代血清培養(yǎng)條件時血管肌細(xì)胞發(fā)生相似的表型調(diào)節(jié)。因此原代培養(yǎng)的動脈平滑肌細(xì)胞能為更大范圍的在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平為研究細(xì)胞反應(yīng)機(jī)理提供有效的模型。已有相關(guān)研究對腸系膜動脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，如用組織塊培養(yǎng)法[3](但分離純化時間較長)，胰蛋白酶消化法[4]或多種酶消化法[5]，本研究采用Ⅰ型膠原酶消化分離腸系膜小動脈平滑肌細(xì)胞，為阻力血管相關(guān)疾病的研究提供可靠且充裕的細(xì)胞來源。

1 材料與方法

1.1試驗動物SPF級雄性Sprague Dawley(SD) 大鼠，體重110～150 g，由南華大學(xué)實驗動物學(xué)部提供。人主動脈血管平滑肌細(xì)胞株(AVSMC)購買于ATCC。

1.2主要試劑DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)均為Hyclone、I型膠原酶粉末購自sigma公司；青-鏈霉素(雙抗) 購自碧云天生物技術(shù)公司；α-肌動蛋白單克隆抗體(α-actin) 抗體購自Abcam公司；胰蛋白酶購自美國Sigma公司；DAB顯色試劑盒購康購自世紀(jì)生物制劑有限公司；MTT試劑購自北京索萊寶；PCNA購自Abcam公司。

1.3主要儀器熒光倒置顯微鏡(日本Olympus)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，酶標(biāo)儀檢測儀(德國Beckman公司)，高性能超凈工作臺(蘇凈基團(tuán)泰安公司)，5810R低溫高速離心機(jī)(德國Eppendorf )，eclipse e100顯微鏡(日本Nikon)。

1.4原代細(xì)胞培養(yǎng)取健康SD大鼠(180～220 g)，配制10%水合氯醛溶液，按照100 g注射0.3 mL的水合氯醛麻醉。剃毛、祛皮、處死老鼠(頸動脈放血)。碘酒、酒精消毒解剖板，將大鼠固定在解剖板上(四肢及頭部)，先用碘酒擦拭大鼠，再用酒精擦拭，至碘酒顏色呈淡黃色;無菌操作下，用解剖鑷開腔，迅速分離腸道組織，仔細(xì)剝離出次級腸系膜動脈，將其轉(zhuǎn)移至無菌操作臺中，更換器械，置于裝有D-Hanks的培養(yǎng)皿中，將動脈外模纖維結(jié)締組織用眼科鑷輕輕剝離干凈。充分漂洗之后，取出放入盛有正常培養(yǎng)基(為含有20% FBS的DMEM培基，雙抗與培基的比例為1∶100)的剝離培養(yǎng)皿中;用眼科剪沿動脈長軸向剪開腸系膜動脈，平鋪使內(nèi)膜朝上，沿著內(nèi)膜用棉簽來回輕刮數(shù)遍并漂洗。 然后將血管反復(fù)剪成碎小組織塊，最后將碎塊移入預(yù)先盛有含0.1%的I型膠原酶的離心管中(酶的體積為組織塊體積的10～15倍)；將此離心管置于CO2培養(yǎng)箱中，每15～20 min輕微搖動一次，密切觀察其消化狀態(tài)，待動脈碎塊消化成透明絮狀物時(消化時間大約需2～3 h)，1 000 rpm離心5 min，棄上清液； 向其加入5 mL含有20%FBS的DMEM培基，充分吹打混勻后轉(zhuǎn)移入25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后開始觀察，6天后可見細(xì)胞呈梭形，并呈“谷-峰狀”，9天后MASMC長滿瓶底的90%，即可行傳代培養(yǎng)。

1.5傳代培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶80%～90%左右融合時，往培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0．25%胰蛋白酶1 mL消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞，待細(xì)胞發(fā)生皺縮變圓，細(xì)胞間隙增大時，棄掉胰酶消化液，停止消化，消化時間大約為2～3 min，再加入5 mL含20%胎牛血清的DMEM培基，多次反復(fù)輕柔吹打培養(yǎng)瓶壁，顯微鏡觀察貼壁細(xì)胞的漂浮情況，將適宜密度的細(xì)胞懸液分置于1～2個培養(yǎng)瓶，加適量20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞傳代至第3～11代時可用于細(xì)胞實驗。

1.6培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞大小、形態(tài)及生長特點。進(jìn)一步用α-actin免疫組化染色鑒定:將第4代細(xì)胞接種于6孔板細(xì)胞爬片，培養(yǎng)12 h后，待細(xì)胞60%融合時；PBS漂洗3遍后，用10%的多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，按照康為世紀(jì)兔Streptavidin-HRP試劑盒(DAB)說明書進(jìn)行操作，用Anti-alpha smooth muscle Actin抗體定性檢測α-actin。

1.7增殖檢測以第3-4代MASMC為研究對象，并與人主動脈血管平滑肌細(xì)胞株(AVSMC)作對照；MTT法測定細(xì)胞活力，Western blot法測定PCNA蛋白表達(dá)，比較兩種來源細(xì)胞的增殖活力。

2 結(jié) 果

2.1 MASMC的生長情況消化分離的原代MASMC呈圓形，懸浮在DMEM培養(yǎng)液中，于培養(yǎng)后2天呈分散狀貼壁生長；培養(yǎng)至第三代后顯微鏡下觀察貼壁的原代MASMC生長旺盛(圖1)，細(xì)胞形狀大致一致，成梭型，胞質(zhì)伸展，聚集成團(tuán)狀生長，平滑肌細(xì)胞特有的“峰-谷”狀明顯；酶消化后原代MASMC生長快速，基本融合成單層，成叢的緊密排列鏡下透明度及遮光性強(qiáng)。

2.2第4代大鼠MASMC與人AVSMC免疫組化染色比較單層細(xì)胞爬片中觀察到大鼠原代MASMC胞漿內(nèi)肌動蛋白表達(dá)較人AVSMC更為明顯，而細(xì)胞形態(tài)較人AVSMC更為不規(guī)則，可能是MASMC在傳代過程中表型轉(zhuǎn)變所至，MASMC處于相對人AVSMC細(xì)胞系更為不穩(wěn)定的狀態(tài)，隨著傳代的次數(shù)增多，MASMC的表型從收縮型向分泌型轉(zhuǎn)變，肌動蛋白表達(dá)相對較少，形態(tài)表現(xiàn)趨于穩(wěn)定。見圖2。

2.3兩種平滑肌細(xì)胞的AngⅡ促增殖比較人AVSMC作為制備成熟的細(xì)胞系，具有生長穩(wěn)定、增殖迅速的特點；而大鼠MASMC作為原代細(xì)胞在傳至10代的過程中仍然處于表型轉(zhuǎn)變中，其增殖速度隨傳代次數(shù)遞增，但仍需在較高血清濃度的培養(yǎng)基中才能穩(wěn)定生長，增殖速度相對緩慢。見圖3、圖4。

3 討 論

血管平滑肌細(xì)胞從分離的腸系膜動脈遷移到動脈外周并生長至密度達(dá)到60%需要7～10天，繼續(xù)生長達(dá)到飽和密度另需7天。開始傳代后1～2天，腸系膜動脈平滑肌細(xì)胞從最初呈現(xiàn)的月牙形逐漸向不穩(wěn)定的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變。酶消化的平滑肌細(xì)胞中起初含有少量內(nèi)皮細(xì)胞，隨著傳至2～3代后消失。腸系膜動脈平滑肌細(xì)胞在接種之后較主動脈平滑肌細(xì)胞需要更長的周期達(dá)到較高密度，在多次傳代中腸系膜動脈平滑肌細(xì)胞較主動脈平滑肌細(xì)胞表現(xiàn)顯著緩慢的生長速度。經(jīng)過數(shù)代純化后分離的腸系膜細(xì)胞呈現(xiàn)典型的“峰-谷”狀生長，且a-Actin抗體免疫組化鑒定人主動脈平滑肌細(xì)胞系和大鼠原代腸系膜動脈平滑肌細(xì)胞90%以上呈陽性。

圖1 大鼠原代MASMC第三代形態(tài)為梭形或長梭形,細(xì)胞呈放射狀或旋渦狀排列，呈現(xiàn)典型的“峰-谷”狀生長A： 40× B：100× C：200× D：400×

圖3 MTT檢測AngⅡ?qū)Υ笫驧ASMC和人AVSMC的增殖影響比較與control組比較*P<0.05，##P<0.01

圖4 AngⅡ?qū)Υ笫驧ASMC和人AVSMC的PCNA蛋白表達(dá)比較與control組比較，*P<0.05，##P<0.01

用10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人主動脈平滑肌細(xì)胞在傳代24 h后，生長至95%左右相當(dāng)于4×105cell/mL；而用20%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠原代腸系膜動脈平滑肌細(xì)胞在傳代72 h后生長至95%左右相當(dāng)于5×104cell/mL。人主動脈平滑肌細(xì)胞系較大鼠原代腸系膜動脈平滑肌細(xì)胞增長迅速。在血管緊張素Ⅱ處理24 h后，MTT分析法顯示人主動脈平滑肌細(xì)胞系仍較大鼠原代腸系膜動脈平滑肌細(xì)胞增長迅速，WB定量測定PCNA表達(dá)也得到相似的結(jié)果。

本研究描述了有效可靠的分離培養(yǎng)大鼠腸系膜次級小動脈的方法。已有文獻(xiàn)報道用膠原蛋白酶Ⅱ型或Ⅲ型與彈性蛋白酶合用消化血管組織分離腸系膜動脈平滑肌細(xì)胞[5-6]。本實驗研究只使用了膠原蛋白酶Ⅰ型，較復(fù)合酶消化法更為經(jīng)濟(jì)、方便。因此，通過本研究，發(fā)現(xiàn)單一膠原酶消化法具有操作簡單、分離過程短、細(xì)胞存活率高等多種優(yōu)點。鑒于以上結(jié)果，本實驗研究成功建立了I型膠原酶消化法來培養(yǎng)大鼠原代腸系膜動脈平滑肌細(xì)胞的方法。

大鼠原代腸系膜動脈平滑肌細(xì)胞在低密度時呈多角形，個體較大，且肌質(zhì)網(wǎng)明顯。短期原代培養(yǎng)的該細(xì)胞保留正常腸系膜動脈平滑肌細(xì)胞的生理學(xué)活性，可用于相關(guān)生理研究。在血清中培養(yǎng)的細(xì)胞仍經(jīng)歷了表型的轉(zhuǎn)變，以至于進(jìn)一步改變細(xì)胞的離子通道、轉(zhuǎn)運體、膜受體和收縮蛋白的正常功能，最終導(dǎo)致該分化型細(xì)胞至關(guān)重要的特性丟失，比如收縮性。

盡管如此，該細(xì)胞的培養(yǎng)為研究動脈平滑肌細(xì)胞增殖的機(jī)制提供了很好的模型。

血管平滑肌細(xì)胞都具有共同的特征，比如肌動蛋白、肌球蛋白的表達(dá)。而生長特征，細(xì)胞增殖模式提示兩種平滑肌細(xì)胞的本質(zhì)差異。電鏡顯示平滑肌細(xì)胞是血管中膜唯一的細(xì)胞類型，其具有既收縮又舒張且含代償作用的雙重功能，為同時滿足這些功能，血管平滑肌細(xì)胞保持不同程度的細(xì)胞外基質(zhì)合成和細(xì)胞分裂的間質(zhì)性基礎(chǔ)，從多能性狀態(tài)向特定功能狀態(tài)分化轉(zhuǎn)變。所以，不同平滑肌細(xì)胞表達(dá)的表型和形態(tài)上差異很大。組胚學(xué)上來看，主動脈和腸系膜平滑肌細(xì)胞都是從間葉細(xì)胞發(fā)育而來的[7]。但是在血管中存在著廣泛的功能異質(zhì)性，主動脈作為具有彈性的非特異功能性導(dǎo)管輸送血液，而肌性小動脈比如腸系膜動脈在血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮十分重要的作用。為發(fā)揮特異的血壓調(diào)節(jié)作用，腸系膜動脈平滑肌細(xì)胞演化成收縮性表型。在體內(nèi)時大多數(shù)平滑肌細(xì)胞表現(xiàn)為收縮性表型，而轉(zhuǎn)換后的相對表型通常作為體外細(xì)胞培養(yǎng)的主要形式。

在兩種平滑肌細(xì)胞中觀察到的表型異質(zhì)性是怎樣形成的？可能是：(1)分化程度較少的平滑肌細(xì)胞特殊亞群在整個細(xì)胞階段持續(xù)分化；(2)區(qū)域特異性的平滑肌細(xì)胞表型異質(zhì)性是已分化細(xì)胞暫時可逆的調(diào)節(jié)變化。特定區(qū)域的平滑肌細(xì)胞表型異質(zhì)性與血管斑塊形成、器官灌注的血管調(diào)節(jié)是怎樣聯(lián)系的？在高血壓中小動脈平滑肌細(xì)胞表現(xiàn)為增生而不是肥大；大血管平滑肌細(xì)胞表現(xiàn)為肥大而不是增生[8]。動脈粥樣硬化斑塊更多的觀察發(fā)生在大動脈中而不是小動脈。這種表型異質(zhì)性對平滑肌細(xì)胞在血管高壓，動脈粥樣硬化形成和器官灌流的血管功能中起著重要的作用。小動脈水平的血流調(diào)節(jié)與容量性血管的不同，在冠狀動脈分支中，小于100 μm的動脈直徑和心外膜大血管以區(qū)域特異性的促進(jìn)器官灌注和對血管活性物質(zhì)響應(yīng)。

大血管對血管活性物質(zhì)如AngⅡ的做出響應(yīng)時并不是起被動的導(dǎo)管功能而是積極的血管調(diào)節(jié)功能，尤其是大血管中血管壁中腎素-血管緊張素的局部存在，AngⅡ調(diào)節(jié)血管功能可能是獨立于血液循環(huán)之外，用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑阻滯AngⅡ的生成促進(jìn)了大血管的順應(yīng)性。在小血管中，由內(nèi)皮源性超極化因子介導(dǎo)的，Ach引起的內(nèi)皮依賴性超極化在SHR患者的腸系膜動脈中減弱，內(nèi)皮依賴性的舒張受損。當(dāng)小動脈內(nèi)皮受到剪切應(yīng)激影響時，促血管新生蛋白因子-2表達(dá)受到抑制，在腸系膜微小血管新生過程中ANG2相關(guān)蛋白增加[9]。

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(本文編輯：蔣湘蓮)