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(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科 廣西 南寧 530021；2.柳州市工人醫(yī)院兒科)

建立高肺血流量型肺動脈高壓動物模型，對深入研究其機(jī)制有至關(guān)重要的作用，Garcia[1]曾在大鼠腹主動脈與下腔靜脈間行穿刺分流術(shù)，正常飼養(yǎng)11周后可建立高肺血流量型肺動脈高壓模型。但是模型飼養(yǎng)周期長達(dá)11周，期間腹主動脈與下腔靜脈間的瘺口存在閉合的可能性，這成為影響模型最終建成的關(guān)鍵問題，并且運(yùn)用傳統(tǒng)右心導(dǎo)管法測量肺動脈壓力后，大鼠立即死亡，無法進(jìn)行自身前后對照。本研究利用在右心室流出道及肺動脈主干均無狹窄的前提下，肺動脈收縮壓與右心室收縮壓基本一致的原理[2-4]，采用經(jīng)胸右心室穿刺法測量右心室壓來間接反映肺動脈壓，對術(shù)后6周大鼠模型進(jìn)行中期篩查，探討建模末期模型成功率是否能明顯提高，右心室壓是否能實(shí)現(xiàn)自身前后對照。

1 材料和方法

1.1動物

健康SD大鼠共46只，雌雄各半，體重200-250g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，并經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2主要的試劑及儀器

5%水合氯醛溶液，肝素注射液(100mg/支)，慶大霉素注射液(80000U/支)，蘇木素，伊紅，12號注射器針頭，小哈巴狗血管夾，8-0帶針縫線，小動物手術(shù)臺，耳釘，一次性使用靜脈輸液針 (0.45×13.5mm)，MPA-CFS心功能分析系統(tǒng)及配套的壓力換能器(上海奧爾科特生物科技有限公司)，體視顯微鏡，光學(xué)顯微鏡，電子天平。

1.3方法

1.3.1 測壓及建立動物模型 大鼠麻醉后仰臥固定，取出一次性使用靜脈輸液針(0.45×13.5mm)，輸液針導(dǎo)管內(nèi)充滿1∶100肝素生理鹽水，通過醫(yī)用三通管將其末端連接壓力換能器，連接到心功能分析系統(tǒng)。打開MPA心功能分析系統(tǒng)，將心室壓B通道定標(biāo)。食指觸摸大鼠心尖搏動最強(qiáng)點(diǎn)并標(biāo)記，在胸部正中線處測量胸骨角及胸骨體的體表長度，并在其7:3處標(biāo)記，在此點(diǎn)及其周圍觸摸，絡(luò)合碘消毒胸前區(qū)及針頭，以搏動最明顯處作為穿刺點(diǎn)，針尖指向心尖標(biāo)記點(diǎn)以60度角方向刺入，進(jìn)針有突破感后緩慢進(jìn)針，可發(fā)現(xiàn)一次性靜脈輸液針隨心跳搏動，心功能分析系統(tǒng)顯示波浪狀壓力曲線，數(shù)值窗口顯示右心室收縮壓、舒張壓及平均壓，提示已進(jìn)入右心室，固定針尖此位置20余秒，之后保存壓力數(shù)值及壓力曲線文件。開腹拉開腸管，暴露腹主動脈及下腔靜脈，用小哈巴狗鉗將腹主動脈夾閉，用12號一次性針頭穿透腹主動脈壁進(jìn)入相鄰的下腔靜脈內(nèi)，用8-0號線荷包縫合腹主動脈壁的穿刺口，腹腔注射慶大霉素200u/kg預(yù)防感染，分層縫合肌層和皮膚。術(shù)后1周，發(fā)現(xiàn)大鼠死亡6只，將存活的大鼠模型按隨機(jī)數(shù)字方法，平均分為實(shí)驗(yàn)組(n=20)及對照組(n=20)，模型大鼠用耳釘編號。術(shù)后6周采用上述方法測量右心室壓，淘汰壓力前后變化小于6mmHg的模型大鼠。

1.3.2 評估模型成功建立情況 術(shù)后11周用上述方法測量右心室壓。觀察模型大鼠一般情況，看其是否出現(xiàn)呼吸急促、趾端口唇紫紺，喜蜷縮等。開腹觀察下腔靜脈大體情況，看其是否明顯增寬，顏色是否呈鮮紅色，是否伴有搏動等；在顯微鏡下分離右心室與左心室+室間隔，用濾紙吸干后用電子天平稱重，計(jì)算右心室肥厚指數(shù)(right ventricle hypertrophy index,RVHI)，即右心室重量/左心室+室間隔重量；將左肺上葉固定，石蠟包埋后做成5um的切片，脫水脫蠟后用蘇木精 - 伊紅(HE)染色，鏡下觀察肺動脈，觀察動脈管壁是否明顯增厚，管腔是否出現(xiàn)狹窄及肌化程度。統(tǒng)計(jì)以上5項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合評估建模末期的模型成功情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1右心室壓變化情況

術(shù)前行右心室壓檢測，右心室平均壓為12.1±1.48mmHg。術(shù)后6周再次測量，實(shí)驗(yàn)組與對照組右心室平均壓分別為(17.87±1.96mmHg)和(17.49±2.51mmHg)，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，術(shù)后6周與術(shù)前壓力比較，顯著高于術(shù)前(P<0.05)。術(shù)后11周，實(shí)驗(yàn)組與對照組右心室平均壓分別為(27.97±3.27mmHg)和(23.67±5.63mmHg)，實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組，(P<0.05)。見圖1及圖2。

圖1 各時間段右心室平均壓力(RVMP)比較(mmHg)與對照組比較，*P<0.05

2.2術(shù)后11周模型大鼠一般情況及下腔靜脈觀察情況

實(shí)驗(yàn)組模型大鼠出現(xiàn)毛發(fā)稀疏，部分可見趾端及口唇紫紺，呼吸急促，活動量減少，喜蜷縮，開腹后發(fā)現(xiàn)下腔靜脈明顯增粗，并呈鮮紅色，伴搏動，對照組模型大鼠部分出現(xiàn)上述變化。

2.3術(shù)后11周模型大鼠右心室肥厚指數(shù)

實(shí)驗(yàn)組與對照組右心室肥厚指數(shù)分別是(0.33±0.02)和(0.28±0.06)，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組(P<0.05)。

2.4術(shù)后11周模型大鼠肺動脈HE染色

HE染色結(jié)果可見實(shí)驗(yàn)組右心室平均壓高于25mmHg的模型大鼠肺動脈發(fā)生了肌化，管壁增厚，管腔出現(xiàn)狹窄，平滑肌增殖明顯，血管周圍有炎性細(xì)胞浸潤；對照組右心室平均壓低于25mmHg的模型大鼠肺動脈肌化程度輕，動脈壁有輕度增厚，管腔未見明顯狹窄。見圖3。

圖2 各時間段采集的右心室壓數(shù)值及曲線A:術(shù)前；B:術(shù)后6周；C:術(shù)后11周(實(shí)驗(yàn)組)；D: 術(shù)后11周(對照組)

圖3 大鼠肺動脈HE染色(200×)A:實(shí)驗(yàn)組；B:對照組

2.5模型大鼠最終成功情況

實(shí)驗(yàn)組成功建模9只，失敗1只，對照組成功建模10只，失敗10只，實(shí)驗(yàn)組與對照組成功率分別為90%和50%，實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組(P<0.05)。

3 討 論

高肺血流量型肺動脈高壓是小兒先天性心臟病左向右型的一種常見的并發(fā)癥，其極大程度增加了患兒圍手術(shù)期風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響了手術(shù)效果和患兒預(yù)后，是患兒病殘和病死的重要原因之一，深入探討肺動脈高壓形成的機(jī)制對先心病的治療和預(yù)后有重要意義。大鼠動靜脈分流模型常運(yùn)用于此研究中，因模型形成過程中有瘺口閉合的可能性，在建模末期模型成功率并不高。傳統(tǒng)的右心導(dǎo)管法測量肺動脈高壓[5-7]，由于其缺乏可重復(fù)性，不能作為模型大鼠自身前后對照的檢測方法。

現(xiàn)國際上已有研究者運(yùn)用右心室壓力變化情況用來間接反映肺動脈壓力變化情況[8-11]，運(yùn)用傳統(tǒng)的右心導(dǎo)管法測量右心室壓操作較為困難，成功率較低，缺乏重復(fù)性。曾有學(xué)者提出在超聲引導(dǎo)下穿刺右心室，在胸骨右緣4-5肋間并緊貼胸骨向心尖方向以60°角斜行刺入[4]，其后又有學(xué)者提出在心尖搏動最強(qiáng)處向頭側(cè)上移0.1-0.3mm作為穿刺點(diǎn)垂直刺入[3]，該方法簡單易行無需超聲輔助，但心臟在跳動過程中，右心室腔的位置也在不斷變化中，所以該方法適用于對心臟的體表投影較為熟悉的操作者。本方法在前人的研究基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，就穿刺點(diǎn)這一問題進(jìn)行了前期大鼠胸部解剖，發(fā)現(xiàn)4-5肋間大致位于胸骨角至胸骨體的7∶3處，穿刺前在胸骨右緣觸摸此處附近心臟搏動較強(qiáng)的點(diǎn)，以協(xié)助準(zhǔn)確定位穿刺點(diǎn)，心尖位置則可由心臟體表搏動最強(qiáng)點(diǎn)來確定，大鼠右心室呈斜向前下的錐體形，向心尖方向以60°角斜行刺入更易刺入右心室腔，方法簡便易學(xué)，并且穿刺后大鼠仍可繼續(xù)存活，一般情況無特殊改變，為實(shí)施自身右心室壓前后對照提供了可行性。術(shù)后11周，右心室平均壓力測量高于25mmHg的模型大鼠出現(xiàn)一般情況、下腔靜脈、右心室肥厚程度及肺動脈病理情況的明顯改變，對比右心室平均壓力測量低于25mmHg的模型大鼠，發(fā)現(xiàn)上述改變不明顯，說明此方法在檢測大鼠肺動脈高壓方面的可靠性。

本研究運(yùn)用改良后的右心室經(jīng)胸穿刺測壓法對肺動脈高壓模型大鼠進(jìn)行多次右心室壓力的測量，在建模中期淘汰部分模型大鼠，明顯提高了建模末期模型的成功率，減少了動物飼養(yǎng)的損耗。此外，本研究亦發(fā)現(xiàn)右心室經(jīng)胸穿刺測壓法在對肺動脈高壓模型大鼠進(jìn)行前后自身對照方面有顯著優(yōu)勢，為后期的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)了一條簡單易行的新思路。

參考文獻(xiàn)：

[1] GARCIA R, DIEBOLD S. Simple, rapid, and effective method of producing aortocaval shunts in the rat[J]. Cardiovasc Res.1990,24(5):430-2.

[2] XIONG M, YAO JP, WU ZK, et al. Fibrosis of pulmonary vascular remodeling in carotid artery-jugular vein shunt pulmonary artery hypertension model of rats[J]. Eur J Cardiothorac Surg.2012,41(1):162-6.

[3] 勞金泉, 鄧燕, 張鋒, 等. 經(jīng)胸右心室穿刺法測量大鼠右心室壓力的研究[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展.2017(04):619-6.

[4] 信怡, 黃國英, 夏紅萍, 等. 大鼠經(jīng)胸右心室穿刺測壓的可行性研究[J]. 復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版).2006(05):639-41.

[5] AIELLO RJ, BOURASSA PA, ZHANG Q, et al. Tryptophan hydroxylase 1 Inhibition Impacts Pulmonary Vascular Remodeling in Two Rat Models of Pulmonary Hypertension[J]. J Pharmacol Exp Ther.2017,360(2):267-79.

[6] DENG C, WU D, YANG M, et al. The role of tissue factor and autophagy in pulmonary vascular remodeling in a rat model for chronic thromboembolic pulmonary hypertension[J]. Respir Res.2016,17(1):65.

[7] FUKUMITSU M, KAWADA T, SHIMIZU S, et al. Wave reflection correlates with pulmonary vascular wall thickening in rats with pulmonary arterial hypertension[J]. Int J Cardiol.2017,249:396-401.

[8] YUNG LM, NIKOLIC I, PASKIN-FLERLAGE SD, et al. A Selective Transforming Growth Factor-beta Ligand Trap Attenuates Pulmonary Hypertension[J]. Am J Respir Crit Care Med.2016,194(9):1140-151.

[9] YANG P, READ C, KUC RE, et al. Elabela/Toddler Is an Endogenous Agonist of the Apelin APJ Receptor in the Adult Cardiovascular System, and Exogenous Administration of the Peptide Compensates for the Downregulation of Its Expression in Pulmonary Arterial Hypertension[J]. Circulation.2017,135(12):1160-73.

[10] LI X, HE Y, XU Y, et al. KLF5 mediates vascular remodeling via HIF-1alpha in hypoxic pulmonary hypertension[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2016,310(4):L299-310.

[11] ZHANG B, NIU W, XU D, et al. Oxymatrine prevents hypoxia- and monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats[J]. Free Radic Biol Med.2014,69:198-207.