, ,, , ,,

(1.南華大學醫(yī)學院腫瘤研究所, 湖南 衡陽 421001; 2.常德職業(yè)技術學院; 3.湖南環(huán)境生物學院醫(yī)學院)

非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma, NHL)主要發(fā)生在淋巴結、脾臟、胸腺等淋巴器官，它是一類常見的淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤，占淋巴瘤總發(fā)病率的70.1%～95.1%。NHL病情進展較快，且它的發(fā)病率和死亡率每年都在穩(wěn)步增加，嚴重威脅著人類的健康安全。但迄今為止，人們對NHL的發(fā)病機制還沒有明確的了解。有研究表明淋巴瘤的發(fā)病機制可能與基因突變、免疫抑制、感染、環(huán)境等因素有關，其中基因突變引起的原癌基因激活和抑癌基因失活是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關鍵原因。因此，尋找可作為腫瘤早期診斷和特異性治療的靶點是NHL治療的關鍵。DJ-1蛋白在人體的組織和器官中廣泛存在，而DJ-1蛋白缺失或過度表達會引起很多相關疾病，在前列腺癌、胰腺癌等多種腫瘤中均有發(fā)現(xiàn)DJ-1過度表達的情況。研究表明這與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉移及預后密切相關[1]。然而，關于DJ-1蛋白在NHL中的表達與淋巴瘤生物學特性的關系國內外尚未見文獻報道。因此，本文旨在探討DJ-1蛋白在NHL中的表達及意義，為NHL的診治提供有價值的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料人淋巴瘤組織芯片(LYM1502)，購于上海卓立生物科技有限公司；病理組織學確診為非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者61例，男31例，女30例，年齡14～80歲，中位年齡42歲；病理組織學確診為非腫瘤淋巴組織7例作為對照組，包含男3例，女4例，年齡7～52，中位年齡34歲。患者臨床、病理及實驗室資料完整，病理類型和惡性程度按照WHO(2016)的標準分類。兔抗人DJ-1抗體購自ABGENT公司,SP免疫組化試劑盒均購自福建邁新生物技術有限公司。

1.2免疫組織化學染色根據(jù)超敏SP免疫組化染色試劑盒說明書進行，使用福建邁新生物有限公司提供的已知陽性片作為對照，同時陰性對照組用PBS處理。

1.3組織芯片染色結果判定組織芯片中黃色、棕黃色、棕褐色部位為蛋白陽性表達。每芯隨機選取三個不重復的400倍視野，每個視野中隨機記數(shù)連續(xù)的200個細胞，記數(shù)每個細胞核與漿中DJ-1蛋白的陽性表達情況，計算陽性表達率。細胞核蛋白表達結果的判定，按細胞核染色強度與細胞核陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的百分比綜合計分，同理，細胞漿蛋白表達結果的判定，按細胞漿染色強度與細胞漿陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的百分比綜合計分。根據(jù)文獻，按染色強度分別計無色者為1分，黃色者為2分，棕褐色者為3分; 按陽性細胞總數(shù)分別計總數(shù)≤25% 者為1分，26%～50%者為2分，51%～75%為3分，>75%者為4分；將每個組織點染色強度與陽性細胞百分率得分相乘的積為其最后得分。1分為陰性“-”，2～4分為弱陽性“+”，5～8分為中等陽性“++”，9～12分為強陽性“+++”[2]。陰性和弱陽性定義為低表達，中等陽性和強陽性定義為高表達。

1.4統(tǒng)計學分析組織芯片結果數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，選用用卡方檢驗和Fisher確切概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 DJ-1在NHL和非淋巴瘤組織中的表達情況采用組織芯片結合免疫組化檢測DJ-1在NHL及非腫瘤組織中的表達情況，如圖1所示。通過鏡下計數(shù)結果如表1所示：NHL中DJ-1蛋白細胞核高表達率分別為72.1%，顯著高于非腫瘤組織(淋巴結反應性增生和正常淋巴結)14.3%(P<0.01)；細胞漿高表達率為93.4%，顯著高于非腫瘤組織(淋巴結反應性增生和正常淋巴結)28.6%(P<0.01)。比較NHL中DJ-1在細胞核與細胞漿中的表達情況，NHL中DJ-1的漿表達率為93.4%,明顯高于核表達的72.1%。

表1 組織芯片結合免疫組化檢測檢測DJ-1在非霍奇金淋巴瘤(NHL)及非腫瘤組織中的表達情況

與非腫瘤組織比較，aP<0.01

2.2 DJ-1的表達與NHL惡性程度的關系所示DJ-1在惰性、侵襲性和高度侵襲性淋巴瘤中核高表達率分別為52.2%、82.9%和100%(P<0.05),細胞漿內為82.6%、100%、100%(P<0.05)。DJ-1的表達與惡性程度正相關，且細胞核內DJ-1高表達率較之細胞漿內梯度差異更為明顯。見表2。

2.3 NHL中DJ-1的表達與性別、年齡和組織學分型的關系為調查DJ-1的表達是否受性別、年齡和組織學分型的影響，以性別、年齡和組織學來源進行分組統(tǒng)計。其結果如表2所示：DJ-1的表達差異與性別、年齡和組織學分型無顯著的相關性(P>0.05)。

圖1 DJ-1在非霍奇金淋巴瘤(NHL)組織及非腫瘤組織中的表達情況(左列100×，右列400×)A:非腫瘤組織，核表達(-)，漿表達(+)； B:非霍奇金淋巴瘤，核表達(+)，漿表達(+++)；C:非霍奇金淋巴瘤，核表達(++)，漿表達(+++)

表2 DJ-1的表達與非霍奇金淋巴瘤惡性程度、性別、年齡和組織學分型的關系

3 討 論

惡性腫瘤的早期診斷對其治療具有著重要的意義，惡性腫瘤在早期階段一般還未具備侵襲轉移的能力，如何在其發(fā)病早期診斷是目前醫(yī)學研究的重點。然而，目前人們對惡性腫瘤的形成機制還不是十分了解，能確定的是基因突變引起的癌基因激活且或抑癌基因失活與腫瘤的形成密切相關，因此如何篩選出腫瘤中突變的癌基因或抑癌基因對腫瘤的早期診斷意義非凡。組織芯片又稱組織微陣列，能同時檢測幾十乃至上千的組織標本，具有高通量、誤差小、可比性強和準確度高等優(yōu)點，能幫助篩選惡性腫瘤中具有潛在診斷意義的分子[3]。運用組織芯片篩選出與淋巴瘤發(fā)生發(fā)展相關的腫瘤生物標記物，對淋巴瘤的診斷、預后評估具有十分重要的意義。

DJ-1蛋白由位于1號染色體短臂遠端(1p36.12-1p36.33)區(qū)域的同名基因表達，分子大小為20 KDa，并以同源二聚體的形式存在，破壞其二聚體結構往往能使其失活[4]。DJ-1是一種多功能的蛋白質，它能夠調節(jié)RNA結合蛋白的亞基，氧化還原分子伴侶[5]，半胱氨酸蛋白酶[6]，轉錄共激活因子[7]等功能。這些功能使DJ-1蛋白牽連著生物過程的各個方面,當然也包括腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。DJ-1蛋白在單獨或者與其他癌基因如c-myc、ras等共同作用時能夠轉化NIH-3T3細胞，暗示了其對基因轉錄有調控作用并具備致癌潛力。本文實驗結果顯示NHL細胞核和細胞漿中DJ-1的表達顯著高于非腫瘤組織，因此可以認為DJ-1與NHL發(fā)生密切相關。

DJ-1作為凋亡過程的一個重要調節(jié)點，與腫瘤的形成發(fā)展緊密相關。DJ-1調控多條致癌信號通路，在細胞核內能與Daxx結合，阻止其進入細胞質激活ASK1，而ASK1的激活能啟動細胞凋亡[8]；DJ-1蛋白在細胞漿中與MEKK1的結合能阻斷MEKK1-SEK1-JNK1級聯(lián)信號通路激活引起的凋亡[9]。由此可見DJ-1參與不同致癌通路的定位是不一樣的，或許根據(jù)DJ-1在細胞內定位表達的情況結合現(xiàn)有研究資料能初步推測DJ-1參與哪些致癌信號通路。本文實驗結果顯示NHL細胞中細胞核和細胞漿中都存在高表達的現(xiàn)象，不過細胞漿中DJ-1高表達較細胞核中更為明顯。有研究表明DJ-1蛋白結構的C106殘基的氧化能阻斷 P53的C末端與啟動子的結合，從而調控促凋亡因子Bax的轉錄并抑制下游Caspase酶的活化[10]，而DJ-1的敲低增加了Bax蛋白水平，并加速caspase-3的激活和細胞死亡。這表明DJ-1的細胞保護是通過抑制p53-Bax-Caspase途徑來介導的[11]。DJ-1對p53的這種抑制活性取決于本身的sumo化，它是泛素化修飾的一種，且主要在翻譯后參與蛋白質的修飾，能使蛋白質構象更加穩(wěn)定并調節(jié)蛋白質的核運輸、信號傳遞等[12]，當Sumo化位點發(fā)生突變時，DJ-1將無法向核內轉移并喪失其通過p53-Bax-Caspase通路誘導細胞凋亡的能力[13]。這種核內轉移的現(xiàn)象或許是本文實驗結果中細胞核和細胞漿中都存在高表達現(xiàn)象，但卻有強弱之別的原因。

尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)能使腫瘤周圍的基質蛋白降解并促進腫瘤的轉移和侵襲[14]，而侵襲和轉移對評估腫瘤的惡性程度及判斷患者預后具有重要意義。DJ-1蛋白能使ERK和SRC磷酸化繼而激活下游的ERK/ uPA通路，因此DJ-1的高表達能促進惡性腫瘤的轉移侵襲。另外多種腫瘤患者體內呈現(xiàn)血清DJ-1蛋白的高水平，而這往往與腫瘤的轉移密切[15]。DJ-1可能作為腫瘤轉移早期診斷和監(jiān)測的潛在生物標志物有著巨大的潛力。在本實驗結果中，DJ-1的高表達率與NHL的惡性程度正相關，即惡性程度高的淋巴瘤中DJ-1的表達更高，故DJ-1可能與NHL的轉移和侵襲等惡性進程密切相關。實驗結果中DJ-1于腫瘤細胞中核、漿內都有高表達，漿表達更加明顯但核表達卻能根據(jù)NHL的惡性程度表現(xiàn)出差異梯度，似乎作為診斷標準更為合適。但在DJ-1臨床應用前仍需擴大實驗標本量并進一步明確該蛋白在NHL中的表達強度與轉移和侵襲的關系。DJ-1作為腫瘤惡性行為的分子診斷指標以及評估患者預后都具有極大潛力和重要意義。

不止于在診斷方面探索，DJ-1在腫瘤的治療方面也有許多研究進展。研究表明DJ-1的沉默能增加腫瘤對藥物的敏感性，使用RNA干擾技術(siRNA)沉默DJ-1基因能使腫瘤細胞生長能力受損并增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性如吉西他濱、順鉑等。這提示DJ-1的高表達與腫瘤耐藥性密切相關，而通過檢測耐藥腫瘤中DJ-1表達情況，使用靶向干擾DJ-1的藥物來抑制DJ-1的表達也許能改善化療藥物的療效，增加化療成功率。因此化療藥物與靶向干擾DJ-1藥物的聯(lián)合治療方法是極具潛力的新型抗腫瘤手段。

參考文獻：

[1] 王娟, 譚暉, 蘇琦. DJ-1在腫瘤中作用的研究進展[J]. 臨床與病理雜志, 2011, 31(6):527-30.

[2] 劉殊, 王士勇, 張暉, 等. NIBP在結腸癌組織中的表達及臨床意義[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學, 2015,23(7):974-7.

[3] 付實, 張琍. 組織芯片技術在消化道腫瘤研究中的應用[J]. 中南醫(yī)學科學雜志, 2017,45(2):183-5.

[4] G?RNER K, HOLTORF E, WAAK J, et al. Structural determinants of the C-terminal helix-kink-helix motif essential for protein stability and survival promoting activity of DJ-1[J]. J Biol Chem， 2007， 282(18): 13680-91.

[5] CULLETON BA, LALL P, KINSELLA GK, et al. A role for the Parkinson’s disease protein DJ-1 as a chaperone and antioxidant in the anhydrobiotic nematode Panagrolaimus superbus[J]. Cell Stress Chaperones, 2015, 20(1):121-37.

[6] KISS R, ZHU M, JóJóRT B, et al. Structural features of human DJ-1 in distinct Cys106 oxidative states and their relevance to its loss of function in disease[J]. Biochim Biophys Acta, 2017,1861(11 Pt A):2619-29.

[7] ISHIKAWA S, TAIRA T, TAKAHASHI-NIKI K, et al. Human DJ-1-specific transcriptional activation of tyrosine hydroxylase gene[J]. J Biol Chem, 2010, 68(51):39718-31.

[8] JUNN E, TANIGUCHI H, JEONG B S, et al. Interaction of DJ-1 with Daxx inhibits apoptosis signal-regulating kinase 1 activity and cell death[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(27):9691-96.

[9] MO J S, KIM M Y, ANN E J, et al. DJ-1 modulates UV-induced oxidative stress signaling through the suppression of MEKK1 and cell death[J]. Cell Death Differ, 2008, 15(6):1030-41.

[10] KATO I, MAITA H, TAKAHASHI-NIKI K, et al. Oxidized DJ-1 inhibits p53 by sequestering p53 from promoters in a DNA-binding affinity-dependent manner[J]. Mol Cell Biol, 2013, 33(2):340-59.

[11] SHINBO Y, TAIRA T, NIKI T, et al. DJ-1 restores p53 transcription activity inhibited by Topors/p53BP3.[J]. Int J Oncol, 2005, 26(3):641-48.

[12] PTAK C, WOZNIAK RW. SUMO and Nucleocytoplasmic Transport[J]. Adv Exp Med Biol, 2017,963:111-26.

[13] FAN J, REN H, FEI E, et al. Sumoylation is critical for DJ-1 to repress p53 transcriptional activity[J]. FEBS Lett， 2008， 582(7): 1151-56.

[14] HE X, ZHENG Z, LI J, et al. DJ-1 promotes invasion and metastasis of pancreatic cancer cells by activating SRC/ERK/uPA[J]. Carcinogenesis， 2012， 33(3): 555-62.

[15] Han B, Wang J, Gao J, et al. DJ-1 as a potential biomarker for the early diagnosis in lung cancer patients[J]. Tumour Biol,2017,39(6):1-7.