，

(南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421001)

成熟的miRNA (microRNA)是一類長(zhǎng)約19-23nt內(nèi)源表達(dá)的非編碼單鏈小RNA分子，其作為基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)和病毒體內(nèi)[1]。miRNA通過(guò)并入到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中并與其互補(bǔ)靶mRNA特異性結(jié)合來(lái)發(fā)揮沉默功能，其靶向mRNA的主要方式包括翻譯抑制、mRNA裂解、改變mRNA穩(wěn)定性。早期研究發(fā)現(xiàn)，miRNA對(duì)發(fā)育時(shí)間、細(xì)胞死亡、細(xì)胞增殖、免疫、神經(jīng)系統(tǒng)模式等生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控至關(guān)重要[2]。

MiR-155-5p定位于人染色體 21q21.3，是一個(gè)典型的多功能miRNA，由 B 細(xì)胞整合簇(稱為BIC或miR-155HG)基因的高保守區(qū)13kb區(qū)域內(nèi) 3 個(gè)外顯子編碼組成[3]。在活化的B/T細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中miR-155-5p均呈現(xiàn)顯著高表達(dá)。值得注意的是由于具有不同的表達(dá)譜,miR-155-5p在免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、造血譜系分化、病毒感染、心血管疾病以及癌癥等病理生理過(guò)程中起關(guān)鍵作用[4]。目前，對(duì)miR-155-5p的研究主要集中在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，所以用生物信息學(xué)方法分析miR-155-5p的靶基因?qū)窈筇剿鱩iR-155-5p在癌癥診斷和治療中的功能作用十分重要。本文通過(guò)對(duì)預(yù)測(cè)得到的miR-155-5p靶基因集合進(jìn)行基因本體論 (Gene ontology， GO)注釋和京都基因與基因組百科全書 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG)分析，了解其生物學(xué)特性及功能，為今后開展miR-155-5p研究提供方向和分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 miR-155-5p的序列保守性分析運(yùn)用miRbase數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.mirbase.org/)在線查找各物種已知的成熟miR155-5p 堿基序列，比對(duì)分析miR-155-5p序列在各物種之間的保守性。

1.2 miR-155-5p的靶基因預(yù)測(cè)采用miRanda (http://www.microrna.org/)，miRDB(http://www.mirdb.org/)，TargetScan(http://www.targetscan.org/)和Clip-Seq(http://mirtarclip.mbc.nctu.edu.tw/) 4個(gè)在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-155-5p的靶基因，用Venny2.1.0畫韋恩圖得到4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果的交集。

1.3 miRNA-155-5p靶基因的GO功能注釋根據(jù)Gene ontology數(shù)據(jù)庫(kù)查找的基因GO注釋，以本物種的所有基因?yàn)楸尘盎?，用超幾何分步法?jì)算P值，顯著性閾值取P<0.05，獲得相對(duì)于背景基因具有統(tǒng)計(jì)意義的GO高頻率注釋。Gene ontology功能注釋由細(xì)胞組件(cellular component)、分子功能(molecular function)、生物過(guò)程(biological process) 3個(gè)部分組成。

1.4 miR-155-5p預(yù)測(cè)靶基因的KEGG Pathway分析用KOBAS 3.0軟件對(duì)預(yù)測(cè)到的miR-155-5p靶基因集合進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析。P值的計(jì)算采用DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中軟件附帶的 Fisher exact test計(jì)算，顯著性閾值取P<0.05，獲相對(duì)于背景基因具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因集合信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

2 結(jié) 果

2.1各物種成熟miR-155-5p序列的保守性分析檢索在線數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase發(fā)現(xiàn)人(has)miR-155-5p基因序列號(hào)為MIMAT0000646，其前體64個(gè)堿基定位于21號(hào)染色體25573980-25574044位。通過(guò)miRBase對(duì)小鼠(mmu)、大鼠 (rno)、野豬 (ssc)等10個(gè)物種的miR-155-5p序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-155-5p的成熟序列“uuaaugcuaaucgugauaggggu”在各物種間高度保守(表1)。

2.2 miR-155-5p的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果閱讀miR-155靶基因相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)miR-155是最常見(jiàn)的參與腫瘤疾病的miRNA之一。miR-155-5p通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其靶基因參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后(表2)。miRanda、miRDB、TargetScan、Clip-Sep 4個(gè)在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-155-5p的靶基因個(gè)數(shù)分別是5 452、313、2 391、1 736，取交集后得到預(yù)測(cè)靶基因202個(gè)，占各預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)的靶基因總和的3.6%(圖1)。

2.3 miR-155-5p預(yù)測(cè)靶基因的GO功能注釋將4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)均能預(yù)測(cè)到的靶基因202個(gè)作GO分析，發(fā)現(xiàn)miR-155-5p的靶基因主要富集在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞器等88個(gè)細(xì)胞組件 (P<0.05)；參與蛋白結(jié)合、雜環(huán)化合物結(jié)合、核酸結(jié)合、DNA結(jié)合、酶結(jié)合等153個(gè)分子功能 (P<0.05)；靶基因的生物學(xué)過(guò)程顯著富集于細(xì)胞進(jìn)程、細(xì)胞大分子代謝過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、有機(jī)物代謝過(guò)程等537個(gè)生物過(guò)程 (P<0.05，表3)。

表1 各物種miR-155-5p的成熟序列

*注：其中大鼠的成熟miR-155-5p序列是通過(guò)預(yù)測(cè)得到，尚無(wú)實(shí)驗(yàn)證明

2.4靶基因KEGG信號(hào)通路富集分析將4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)都能預(yù)測(cè)到的miR-155-5p的靶基因集合作KEGG Pathway分析，發(fā)現(xiàn)miR-155-5p的靶基因顯著富集在癌癥通路、HTLV-I感染、內(nèi)分泌抵抗、MAPK信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等(P<0.05，表4)。

3 討 論

MiRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與其靶基因特異性結(jié)合，進(jìn)而形成一個(gè)巨大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，廣泛參與人類生命活動(dòng)和疾病的各個(gè)方面[1]。近年來(lái)已有大量研究證實(shí)miR-155-5p在人類生命活動(dòng)各個(gè)方面扮演著重要的角色，miR-155-5p通過(guò)調(diào)控其靶基因的方式，在免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生、炎癥等生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用。

然而對(duì)miR-155-5p靶基因及其功能的認(rèn)識(shí)還只是冰山一角，因此，預(yù)測(cè)其靶基因和認(rèn)識(shí)它們的相互作用，是了解miR-155-5p在不同的生理過(guò)程中的功能的關(guān)鍵。考慮到靶基因預(yù)測(cè)過(guò)程中miRNA與mRNA雙鏈特異結(jié)合的熱穩(wěn)定性、miRNA與靶基因結(jié)合位點(diǎn)的序列匹配、序列的保守性等因素，本研究選用4種miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件，用不同的計(jì)算方法預(yù)測(cè)靶基因，取交集作為進(jìn)一步分析的miR-155-5p靶基因集合。這種預(yù)測(cè)方法具有高特異性和低假陽(yáng)性率的優(yōu)點(diǎn)，用作分析的靶基因集合具有良好的代表性。

表2 miR-155-5p調(diào)控靶基因參與人類的腫瘤

*注：相對(duì)于正常細(xì)胞或鄰近癌組織細(xì)胞miR-155-5p在癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

圖1 miR-155-5p的預(yù)測(cè)靶基因個(gè)數(shù)

表3 miR-155-5p靶基因的GO功能分析

表4 miR-155-5p靶基因KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果

本研究采用生物信息學(xué)方法，共預(yù)測(cè)得到202個(gè)miR-155-5p的靶基因, 對(duì)獲得的靶基因集合進(jìn)行GO注釋和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)靶基因主要存在于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞器等各個(gè)組分中，參與蛋白結(jié)合、雜環(huán)化合物結(jié)合、核酸結(jié)合、DNA結(jié)合、酶結(jié)合等分子功能，顯著富集于細(xì)胞進(jìn)程、細(xì)胞大分子代謝過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、有機(jī)物代謝過(guò)程等生物過(guò)程以及癌癥通路、HTLV-I感染、內(nèi)分泌抵抗、MAPK信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等。

分析結(jié)果顯示，已知的成熟miR-155-5p序列在人、小鼠、鴨嘴獸等物種間具有高度保守性和同源性，表明miR-155-5p可能與多種生物的某些共同功能有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)miR-155-5p通過(guò)下調(diào)腫瘤抑制基因如CDC73[14]、TP53INP1[3, 15]和DMTF1[16]發(fā)揮促癌作用，也可通過(guò)靶向腫瘤原癌基因如claudin-1[17]和c-Myc[13]發(fā)揮抑癌作用[6](見(jiàn)表2)。這可能是因?yàn)閙iRNA與靶基因之間具有復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(同一miRNA能夠調(diào)控多個(gè)靶基因，同一靶基因又能同時(shí)被多個(gè)miRNA調(diào)控[21])，或可能是因?yàn)閙iRNA在不同組織中參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不同[1]，從而導(dǎo)致了這種功能上的巨大差異。另外大量研究也發(fā)現(xiàn)miR-155在活化的B/T細(xì)胞、樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，是涉及腫瘤疾病最常見(jiàn)的miRNA之一[4]。大量研究表明不僅在活化的B細(xì)胞來(lái)源的淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤)中miRNA-155-5p高度過(guò)表達(dá)[14]，而且在不同來(lái)源的實(shí)體腫瘤(食管癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、肝癌)中也呈現(xiàn)出過(guò)表達(dá)，因此miRNA-155-5p可作為多種腫瘤早期診斷、分期和預(yù)后判斷的重要生物標(biāo)志物。此外，研究還發(fā)現(xiàn)miR-155在炎癥(類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用[22]，突出了炎癥與癌癥之間的潛在聯(lián)系，但目前miR-155-5p參與非腫瘤性疾病的潛在致癌機(jī)制和發(fā)病機(jī)制還沒(méi)有完全闡明。

本文采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miRNA-155-5p靶基因，對(duì)全面認(rèn)識(shí)miR-155-5p靶基因所參與的細(xì)胞組成、分子功能、生物學(xué)過(guò)程，以及進(jìn)一步研究miR-155-5p生物功能機(jī)制可提供參考依據(jù)。但預(yù)測(cè)所得到的靶基因不可避免的存在假陽(yáng)性，所以對(duì)靶基因功能和其所參與的生物學(xué)過(guò)程研究還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

[1] DONG H, LEI J, DING L, et al. MicroRNA: function, detection, and bioanalysis[J]. Chem Rev, 2013, 113(8): 6207-33.

[2] MO YY. MicroRNA regulatory networks and human disease[J]. Cell Mol Life Sci, 2012, 69(21): 3529-31.

[3] ZHANG CM, ZHAO J, DENG HY. MiR-155 promotes proliferation of human breast cancer MCF-7 cells through targeting tumor protein 53-induced nuclear protein1[J]. J Biomed Sci, 2013, 20: 79.

[4] ELTON TS, SELEMON H, ELTON SM, et al. Regulation of the MIR155 host gene in physiological and pathological processes[J]. Gene, 2013, 532(1): 1-12.

[5] FU X, WEN H, JING L, et al. MicroRNA-155-5p promotes hepatocellular carcinoma progression by suppressing PTEN through the PI3K/Akt pathway[J]. Cancer Sci, 2017, 108(4): 620-31.

[6] ZHU M, WANG M, YANG F, et al. MiR-155-5p inhibition promotes the transition of bone marrow mesenchymal stem cells to gastric cancer tissue derived MSC-like cells via NF-κB p65 activation[J]. Oncotarget, 2016, 7(13): 16567-80.

[7] AL-HAIDARI AA, SYK I, THORLACIUS H. MiR-155-5p positively regulates CCL17-induced colon cancer cell migration by targeting RhoA[J]. Oncotarget, 2017, 8(9): 14887-96.

[8] WANG Q, LI C, ZHU Z, et al. MiR-155-5p antagonizes the apoptotic effect of bufalin in triple-negative breast cancer cells[J]. Anticancer drugs, 2016, 27(1): 9-16.

[9] LING N, GU J, LEI Z, et al. MicroRNA-155 regulates cell proliferation and invasion by targeting FOXO3a in glioma[J]. Oncol Rep, 2013, 30(5): 2111-8.

[10] LEI K, DU W, LIN S, et al. 3B, a novel photosensitizer, inhibits glycolysis and inflammation via miR-155-5p and breaks the JAK/STAT3/SOCS1 feedback loop in human breast cancer cells[J]. Biomed Pharmacother, 2016, 82: 141-50.

[11] BABA O, HASEQAWA S, NAGAI H, et al. MicroRNA-155-5p is associated with oral squamous cell carcinoma metastasis and poor prognosis[J]. J Oral Pathol Med, 2016, 45(4): 248-55.

[12] BHATTACHARYAS, CHAIK AM, NG AJ, et al. Increased miR-155-5p and reduced miR-148a-3p contribute to the suppression of osteosarcoma cell death[J]. Oncogene, 2016, 35(40): 5282-94.

[13] SUN S, SUN P, WANG C, et al. Downregulation of microRNA-155 accelerates cell growth and invasion by targeting c-myc in human gastric carcinoma cells[J]. Oncol Rep, 2014, 32(3): 951-6.

[14] RATHER MI, NAGASHRI MN, SWAMY SS, et al. Oncogenic microRNA-155 down-regulates tumor suppressor CDC73 and promotes oral squamous cell carcinoma cell proliferation: implications for cancer therapeutics[J]. J Biol Chem, 2013, 288(1): 608-18.

[15] GIRONELLA M, SEUX M, XIE MJ, et al. Tumor protein 53-induced nuclear protein 1 expression is repressed by miR-155, and its restoration inhibits pancreatic tumor development[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(41): 16170-5.

[16] PENG Y, DONG W, LIN TX, et al. MicroRNA-155 promotes bladder cancer growth by repressing the tumor suppressor DMTF1[J]. Oncotarget, 2015, 6(18): 16043-58.

[17] QIN W, REN Q, LIU T, et al. MicroRNA-155 is a novel suppressor of ovarian cancer-initiating cells that targets CLDN1[J]. FEBS lett, 2013, 587(9): 1434-9.

[18] CAI ZK, CHEN Q, CHEN YB, et al. MicroRNA-155 promotes the proliferation of prostate cancer cells by targeting annexin 7[J]. Mol Med Rep, 2015, 11(1): 533-8.

[19] GU J, LU Z, JI C, et al. Melatonin inhibits proliferation and invasion via repression of miRNA-155 in glioma cells[J]. Biomed Pharmacother, 2017, 93:969-75.

[20] LIU F, SONG D, WU Y, et al. MiR-155 inhibits proliferation and invasion by directly targeting PDCD4 in non-small cell lung cancer[J]. Thorac Cancer, 2017, 8(6):613-9.

[21] 陳蓓蓓, 馬睿玲, 孫少伯,等. 當(dāng)歸對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌miR-122的影響及其生物信息學(xué)分析[J]. 中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志, 2016, 24(4): 345-49.

[22] LI X, TIAN F, WANG F. Rheumatoid arthritis-associated microRNA-155 targets SOCS1 and upregulatesTNF-α and IL-1β in PBMCs[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14 (12): 23910-21.