董 倩,歐 元,韓俊萍,李彩霞,尚 蕾,趙 蕾,丁光樹,孫 輝,李萬水,葉 健,朱波峰*,孫 敬*

(1.西安交通大學口腔醫(yī)學院陜西省顱頜面精準醫(yī)學研究重點實驗室;陜西省牙頜疾病臨床醫(yī)學研究中心,中國陜西西安710004;2.公安部物證鑒定中心北京市現(xiàn)場物證檢驗工程技術研究中心;法醫(yī)遺傳學公安部重點實驗室,中國北京100038;3.北京市公安局朝陽分局刑事偵查支隊,中國北京100025)

Y-STR為正常男性所特有,呈父系遺傳,在法醫(yī)領域中,尤其對男女混合檢材及父權鑒定發(fā)揮著獨特的作用,此外,對于家系排查、縮小偵查范圍、調(diào)整偵查方向同樣具有重要意義。1997年Prinz等[1]首次建立了Y-STR復合擴增體系,將其命名為Quadruplex I,并做了法醫(yī)學應用性研究。此后,許多研究者通過各種嘗試和探索開發(fā)了新的Y-STR復合擴增體系[2,3]。

目前國內(nèi)外學者主要側重于多個Y-STR基因座的體系構建和遺傳多態(tài)性研究[4～7],缺乏對Y-STR快速分型和檢測體系的構建研究。常規(guī)的DNASTR分型要經(jīng)過DNA的提取、純化、PCR擴增和電泳檢測,需要8～10 h,其中最耗時的過程就是PCR擴增,將近3～4 h。為了提高檢驗效率,人們提出了快速PCR技術[8,9]。本研究首次在國內(nèi)構建了符合中國人群的16個Y-STR基因座的快速復合擴增體系,明顯提高了樣品檢測效率,對日常Y-STR數(shù)據(jù)庫的建設和一些特殊案件的初步排查具有一定的實際意義。

1 材料與方法

1.1 實驗樣本

初始濃度為10 ng/μL的DNA標準品9948購自美國MCLAB公司;血卡由實驗室日常積累而來;血液樣本DNA由M48 QIAGEN?試劑盒提取獲得。

1.2 主要試劑與儀器

M48 QIAGEN?試劑盒(QIAGEN公司,德國);蛋白酶 K(Merck公司,德國);FastStart Taq DNA Polymerase和PCR Optimization Kit(Roche Applied Science公司,德國);STR基因座引物(生工生物工程(上海)股份有限公司);ProPlex熱循環(huán)儀、3130xl型遺傳分析儀(Applied Biosystems公司,美國)。

1.3 基因座信息

本研究選取Y染色體非重組區(qū)上的16個STR基因座,包括“歐洲最小單倍群”7個基因座:DYS19、DYS385a/b、DYS390、DYS391、DYS392 和DYS393;SGMDNA學會推薦的2個基因座:DYS-438、DYS439;7個適合中國人群的高度多態(tài)性基因座:DYS437、DYS448、DYS456、DYS458、DYS-635、DYS447和Y_GATA H4。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 擴增條件的初步選擇

將實驗分為3組,采用3種不同的擴增程序,即Typer 15試劑盒程序(A)、羅氏試劑盒擴增程序(B)、GlobalFilerTMExpress Kit(C),進行初步選擇,擴增條件見表1。反應體系最初根據(jù)羅氏試劑盒說明書為10 μL,包括10×FastStart High Fidelity Reaction Buffer(MgCl2)1 μL,dNTP Mix(10 mmol/L)0.2 μL,DNA TyperTM15 引物混合物 1 μL,快速熱啟動酶(5 U/μL)0.4 μL,DNA標準品模板9948(1 ng/μL)1μL,去離子水補足至 10 μL。實驗重復5次。

表1 PCR擴增程序Table1 PCR amplification procedures

1.5 反應體積的選擇

將反應體積分為 4 組,分別為 10 μL、15 μL、20 μL、25 μL,體積配比見表2。采用 1.4 建立的擴增PCR條件,平行比對4種體積的擴增效果,根據(jù)等位基因是否丟失和峰的均衡性選擇最佳體積,實驗重復5次。

1.6 熱啟動酶用量的篩選

將FastStart高保真聚合酶用量篩選實驗分為4組,建立10 μL反應體系,體系配置見表3。根據(jù)1.5實驗結果選取合適的條件作為擴增程序,用去離子水代替9948模板作為陰性對照,實驗重復5次。

表2 PCR擴增體積篩選體系Table2 Volume-selective systems for PCR amplification

1.7 引物平衡調(diào)整

將各基因座上下游引物等比混合配成引物混合物,采用1.6中10 μL體系及優(yōu)選的擴增程序B進行分析。實驗主要根據(jù)同種熒光標記的各基因座的等位基因熒光信號強度的高低,微調(diào)相對應基因座引物的濃度,至全部峰高較為均衡,最終確定各基因座引物濃度。

1.8 快速復合PCR擴增程序的優(yōu)化

根據(jù)1.7采用的最佳擴增體系對1.4初步采用的擴增程序進行快速復合擴增程序優(yōu)化。1）將實驗分為 5 組,循環(huán)次數(shù)分別為 26、27、28、29、30次,其他步驟同1.4優(yōu)選的程序,確定最佳的循環(huán)次數(shù);2）將循環(huán)反應中95℃變性時間分為5組,分別為 2 s、3 s、4 s、5 s、7 s,確定最佳變性時間;3）將循環(huán)中的退火溫度分為6組,分別為55℃、57℃、59℃、61℃、63℃、65℃,確定最佳退火溫度;4）將退火時間分為 5 組,分別為 5 s、10 s、20 s、30 s、40 s,其他程序采用已經(jīng)優(yōu)選的程序;5）將循環(huán)中的延伸時間分為 5 s、10 s、20 s、30 s、40 s,確定最佳延伸時間;6）將終延伸時間分為5組,分別為 1 min、3 min、5 min、7 min、9 min,確定最佳終延伸時間,每個實驗均重復5次。

1.9 PCR緩沖液的篩選

利用PCR Optimization Kit中提供的常見的13種buffers(含有不同pH值和Mg2+濃度,具體見表4)以及高保真的緩沖液,采用1.6中建立的10 μL反應體系及1.8中建立的快速PCR擴增條件,平行比對14種buffers的擴增性能,根據(jù)擴增結果選取最佳快速PCR的擴增buffer。

1.10 精確性和片段準確性的研究

將20份等位基因分型標準物與上樣緩沖液按1∶9比例混合,3130xl電泳檢測,重復5次。然后根據(jù)其分型結果計算等位基因片段的大小均值和標準差,以評估所構建Y-STR快速復合擴增體系的精確性。其次,選取300份M48提取的血卡DNA樣本,用構建的快速復合擴增體系進行檢測,同時9948為陽性對照,去離子水為陰性對照,5個重復,以評估所構建快速體系分型的準確性。

表3 熱啟動酶用量篩選體系Table3 A selective system for the amount of the heat-activated enzyme

表4 13種緩沖液所含MgCl2濃度及其pH值Table4 The concentration of MgCl2and its pH value in 13 kinds of buffers

1.11 案例樣本的研究

為了評估16重Y-STR快速復合擴增體系處理實際樣本的能力,以及其遺傳多態(tài)性性能,用本研究所構建的Y-STR快速擴增體系對日常實驗室積累的300份男性樣本進行了研究,同時用公安部物證鑒定中心自主研發(fā)的Y29試劑盒和閱微基因技術有限公司的MRY29試劑盒進行陽性對照實驗,旨在用不同試劑盒驗證對同一樣本分型結果的準確性。

2 結果

2.1 擴增條件的初步選擇

采用表1所示3個擴增條件分別進行擴增,經(jīng)3130xl遺傳分析儀毛細管電泳檢測后結果如圖1所示。A、B、C分別為3種不同擴增程序的擴增產(chǎn)物電泳圖,程序C為GlobalFilerTMExpress Kit,未得到任何產(chǎn)物;程序A和程序B的擴增結果出峰完全,沒明顯差異。考慮到程序B擴增時間明顯縮短,初步選擇程序B為后續(xù)擴增實驗的標準程序。

2.2 反應體積的篩選

通過比較4個反應體積的擴增結果,發(fā)現(xiàn)10 μL反應體系在保證獲得16個基因座的完整STR分型前提下試劑消耗最少,而且其他3個反應體積都出現(xiàn)不同程度的等位基因丟失、擴增產(chǎn)物峰高較低以及峰高不均衡等現(xiàn)象,故選擇10 μL作為快速反應的終體積。

2.3 熱啟動酶用量的篩選

在初選擴增程序下,比較不同用量的熱啟動酶對擴增效果的影響,結果顯示,雖然各酶量擴增結果均未見等位基因丟失,未出現(xiàn)非特異擴增現(xiàn)象,但是隨著熱啟動酶用量的增加,擴增產(chǎn)物峰逐漸增加,同種熒光基因座間的平衡性更均衡(圖2),故后續(xù)實驗反應體系中均加入0.4 μL熱啟動酶。10 μL標準反應體系為10×FastStart High Fidelity Reaction Buffer(MgCl2)1 μL,dNTP Mix(10 mmol/L)0.2 μL,10×引物混合物 1 μL,熱啟動酶(5 U/μL)0.4 μL,9948 模板(1 ng/μL)1 μL,去離子水 6.4 μL。

圖1 不同PCR條件下9948產(chǎn)物的電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis profiles of 9948 products under different PCR conditions

圖2 不同濃度熱啟動酶條件下9948產(chǎn)物的電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis profiles of 9948 products under different concentrations of hot start enzyme

2.4 引物平衡調(diào)整

根據(jù)擴增分型結果的峰高對引物濃度進行微量調(diào)整以達到基因座間峰高的均衡。最終檢測結果見圖3,各基因座等位基因譜帶清晰,且擴增的產(chǎn)物峰高較為均衡,峰型對稱尖銳,無非特異性峰,分型結果準確。各基因座引物終濃度配比見表5。

2.5 快速復合PCR擴增程序的優(yōu)化

2.5.1 循環(huán)次數(shù)

利用確定好的標準程序和10 μL標準體系對循環(huán)次數(shù)進行優(yōu)化,擴增結果顯示,26、27個循環(huán)時產(chǎn)物峰高明顯過低不易分型,從28至30個循環(huán)時均可得到完整基因座分型結果,產(chǎn)物峰高強度隨循環(huán)數(shù)增加而增加(圖4)。其中,28和29個循環(huán)時峰高明顯改善且均衡性好;30個循環(huán)時,出現(xiàn)個別基因座峰的滲透、非特異擴增和基因座間峰高的均衡性變差,因而根據(jù)實際樣本選擇28或29作為PCR循環(huán)次數(shù)。

圖3 調(diào)整后全部引物復合擴增檢測結果Fig.3 The results of composite amplification test of all primers after adjustment

2.5.2 變性時間

利用標準程序B及10 μL標準體系對循環(huán)中變性時間進行優(yōu)化,實驗結果顯示,變性時間從2 s延長至7 s時,除DYS458和DYS392基因座的峰高均衡性較差外,其余基因座均可得到完整分型結果,擴增產(chǎn)物峰高、均衡性均未見明顯變化。由于7 s相比5 s,DYS458和DYS392基因座的峰高均衡性更好(圖5),故選擇7 s作為PCR擴增循環(huán)中的變性時間。

圖4 不同循環(huán)次數(shù)條件下9948產(chǎn)物的電泳圖譜Fig.4 Electrophoresis profiles of 9948 products under different cycles

2.5.3 退火溫度及時間

采用2.5.2程序和擴增體系先后對循環(huán)中的退火溫度和退火時間進行優(yōu)選。退火溫度的考察結果如圖6所示,從圖中可知,退火溫度為55℃時,個別基因座出現(xiàn)非特異性擴增(圖6A);63～65℃時,出現(xiàn)基因座丟峰,尤其是65℃時可見大部分基因座峰丟失(圖6B);57～61℃時,沒有丟峰現(xiàn)象,但59℃時基因座間均衡性最佳(圖6C)。關于退火時間,5～10 s時等位基因丟失逐漸減少,產(chǎn)物峰的信號強度逐漸增大;20～40 s時,各基因座分型均完整準確,但是與20 s相比,30 s時擴增產(chǎn)物的峰高和等位基因峰值均衡性更佳,且與40 s無明顯差異?；谝陨辖Y果,選擇59℃、30 s作為快速PCR擴增循環(huán)中的退火溫度和退火時間。

2.5.4 延伸時間和終延伸時間

采用1.4中的程序B和10 μL標準體系對循環(huán)中的延伸時間和終延伸時間進行優(yōu)選,實驗擴增結果顯示,延伸時間為10～30 s、終延伸時間為3～9 min時均無非特異性峰和基因座丟失,且產(chǎn)物峰值間均衡性無明顯變化。因此,快速PCR擴增循環(huán)中的最佳延伸時間設為10 s,終延伸時間設為3 min。

綜合以上優(yōu)選結果,最終確定的快速PCR條件為95℃4 min;95℃7 s,59℃30 s,72℃10 s,28或29個循環(huán);72℃3 min;25℃保溫。共需30 min。

2.6 PCR緩沖液的篩選

將實驗中選擇的13種緩沖液和試劑盒推薦的 10×FastStart High Fidelity Reaction Buffer加入確定的最佳10 μL PCR擴增體系,結果顯示所選擇13種緩沖液的擴增結果均出現(xiàn)大部分等位基因丟失,只有D2緩沖液10×FastStart High Fidelity Reaction Buffer分型完整(圖7)。故采用D2緩沖液10×FastStart High Fidelity Reaction Buffer作為反應的緩沖液。

2.7 精確性和片段準確性研究

為了評估本研究構建的16個Y-STR快速體系實際處理案件樣本的能力,我們首先對16個基因座的等位基因片段進行了測序分析,每個位點的測序結果與位點的實驗檢測位置一一對應,從而科學地驗證了位點信息的準確性,部分結果見圖8。隨后,采用等位基因標準品allelic ladder重復20次進行電泳檢測以驗證該快速體系分型的精確性,用血液提取DNA樣本進行擴增以檢驗該快速體系分型的準確性,結果如圖9所示。從圖9可知,等位基因標準品allelic ladder峰高和均衡性良好;重復20次后等位基因標準品allelic ladder在對應等位基因的片段的標準差均在0.2個核苷酸內(nèi),體現(xiàn)了較好的精確度;300份樣本DNA等位基因的相應片段大小與allelic ladder相應片段差值均在0.3個核甘酸內(nèi),完全在儀器誤差允許的范圍內(nèi)。以上結果說明構建的16個基因座的快速復合擴增體系能夠精確并且準確地對樣本進行分型。

圖5 DYS458和DYS392基因座在7 s和5 s變性時間下的分型檢測結果Fig.5 The results of detecting DYS458 and DYS392 loci with the denaturation times of 7 s and 5 s

圖6 不同退火溫度下9948擴增產(chǎn)物的檢測結果Fig.6 The results of the 9948 amplification products at different annealing temperatures

圖7 不同緩沖液下PCR的9948產(chǎn)物的電泳圖譜Fig.7 Electrophoresis profiles of the 9948 products of PCR under different buffers

2.8 案例樣本的研究

本研究所構建的Y-STR快速復合擴增體系對300份日常積累檢材擴增的檢出率為100%。同時,我們用閱微基因有限公司的MRY29試劑盒、公安部物證鑒定中心的Y29試劑盒與我們所構建的Y-STR快速復合擴增體系對多種案例樣本進行了交叉性對比驗證,分型結果完全一致(圖10)。此外,常規(guī)Y29試劑需要的擴增時間為3 h,MRY29需要96 min,而本研究所構建的快速擴增體系可在30 min內(nèi)完成擴增。從以上分析可知,本研究構建的Y-STR快速體系在保證了分型準確的前提下,明顯縮短了檢驗時間。

2.9 遺傳多態(tài)性

Y-STR快速復合擴增體系的構建是為了在短時間內(nèi)起到初步排查的目的,本研究同時對實驗室收集的300份男性個體樣本進行了遺傳統(tǒng)計學分析;各基因座等位基因與單倍型檢出頻率采用直接計數(shù)法,基因多樣性(genetic diversity,GD)值按公式(pi為各等位基因頻率)計算[10]。結果表明Y-STR中的16個基因座的基因多態(tài)性(GD)在0.420至0.985之間(表6),其中DYS391最低為0.420,DYS385a/b最高為0.985,其余基因座的GD都在0.5以上,300名男性個體檢測得到了298種單倍型,顯示了很高的個體區(qū)分能力。

圖8 Y-STR基因座的等位基因片段測序結果Fig.8 The allele sequences of Y-STR locus

圖9 等位基因allelic ladder與300份樣本檢測結果Fig.9 The testing results of allelic ladders and the 300 samples

圖10 不同Y-STR試劑盒對同一煙蒂樣本的擴增檢測分型圖Fig.10 The amplificationdetectionprofilesofthe samecigarette buttsample bythe MRY29,Y29 andY-STRrapidsystems

3 討論

Y-STR基因座具有群體差異性,對歐洲人群個體識別能力高的單倍型并不一定對中國人群也高。近年來關于Y-STR的研究主要集中在某個特定地區(qū)的遺傳多態(tài)性研究,缺乏對Y-STR快速體系構建的研究。雖然國內(nèi)外均有許多商品化的快速試劑盒,但主要以常染色體試劑為主。而且,國內(nèi)Y-STR快速試劑中PCR的擴增時間一般為一個半小時,仍然難以滿足案件日益增長的需求。目前,快速PCR技術主要通過DNA聚合酶的改進、添加劑的研制及結合高性能的PCR擴增儀來實現(xiàn)短時間內(nèi)的擴增[11]。本研究旨在首次在國內(nèi)構建適合中國人群的Y-STR快速擴增體系。

在快速體系構建中,DNA聚合酶的活化程度和用量都對PCR的擴增起著關鍵性的作用。本研究中,我們在選擇的最佳快速10 μL反應體系中分別加入0.1～0.4 μL熱啟動酶,實驗結果均可得到16個STR基因座的完整分型,而且隨著聚合酶用量的增加,擴增產(chǎn)物的峰高明顯增強,峰之間的均衡性明顯改善,考慮到實踐樣本中DNA純度的差異和抑制物的存在,實驗最終選擇DNA聚合酶用量為0.4 μL,以確保分型成功率。在微調(diào)混合引物濃度時,發(fā)現(xiàn)FAM標記的DYS458和DYS392基因座的平衡性較差,將DYS392基因座引物體積從1.0 μL增加至7.0 μL時,峰高仍很低,無明顯改善。其實,單擴DYS392時基因座峰高正常,而將其與DYS458復合擴增時,DYS392明顯受到抑制,可能是兩基因座的引物間形成了二聚體。實驗中將變性時間從5 s延至7 s,結果顯示抑制明顯減弱,峰高增強。在PCR循環(huán)中,延伸時間主要取決于DNA聚合酶的延伸速率,本文構建的快速擴增體系的一個關鍵技術在于采用Roche快速熱啟動酶,它的優(yōu)點是具有更高的耐變性溫度、更高延伸活性和更快的延伸速率,可明顯縮短整個PCR擴增時間[9]。本研究通過反復對比實驗確定了快速擴增中各個最佳參數(shù),最終獲得STR分型完整、各基因座間峰高均衡較好、無非特異性擴增和等位基因丟失的擴增結果。

表6 300份男性樣本中16個基因座的GD值Table6 The GD values of the 16 loci of 300 male samples

Mg2+是DNA聚合酶激活的必備因子,最佳Mg2+濃度可使PCR增擴反應的效率和特異性最佳[12,13]。同一緩沖液中,pH值的不同也會影響酶的活性,進而影響PCR擴增效率。本研究比較了14種不同pH不同Mg2+濃度緩沖液對PCR擴增反應的影響,通過比較分型完整性、峰高及各基因座間平衡性等參數(shù),最終選擇10×FastStart High Fidelity Reaction Buffer。

退火溫度對PCR的擴增起著關鍵性的作用,解鏈溫度(melting temperature,Tm)是DNA雙鏈解旋至一半時所需要的溫度,此時PCR引物的特異性最強,但是與模板DNA結合的能力最弱,為了平衡引物與模板特異性和結合能力,一般推薦退火溫度為(Tm-10)～(Tm-5)℃[14],本文實驗結果顯示,59℃退火溫度不但可以保證擴增效率,而且基因座間均衡性最佳。

為了評估構建的16個基因座的Y-STR快速體系的實際應用價值,本研究首先對其等位基因標準品ladder的精確性和準確性進行了評估,20次ladder電泳檢測和300份樣本擴增檢驗的等位基因相應位置均值和均差在0.5個核苷酸之內(nèi),說明我們所構建的體系能夠精確并準確地對樣本進行分型。

此外,采用本文所構建的Y-STR快速試劑對實驗室收集的300份樣本進行了檢驗,同時采用陽性對照Y29試劑盒進行平行驗證,結果表明300份男性樣本分型成功率為100%,且與Y29試劑盒結果完全一致。Y-STR快速試劑在保障樣本分型準確的前提下將常規(guī)3 h的擴增時間縮短至30 min。對300份男性樣本的遺傳學研究表明16個Y-STR基因座具有識別不同個體的能力,可以在極短時間內(nèi)用于家系排查和性犯罪案件,滿足公安實戰(zhàn)時效性的需求。

本研究首次在國內(nèi)構建的Y-STR快速復合擴增體系可在短時間內(nèi)獲得特異性高、峰高均衡、STR分型準確的DNA結果,對公安實戰(zhàn)中可疑人員初步快速的排查具有一定的現(xiàn)實意義。

致謝：本研究生物樣本來源于國家人類遺傳資源共享服務平臺(YCZYPT[2017]01-3,Biological samples were provided by NICGR)。

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